枯草芽孢杆菌的知识你了解多少？

　　枯草芽孢杆菌作为一种革兰氏阳性细菌，由于其具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础及生产技术，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白的理想宿主，成为原核表达系统中的一种重要的模式菌株。

　　枯草芽孢杆菌用途多多，下面介绍一下用它进行蛋白表达的具体操作：

　　枯草芽孢杆菌表达系统蛋白表达SOP

　　01、针对外源基因片段进行密码子优化，基因合成目的片段。

　　02、将目的基因片段连接到穿梭表达载体上，转化大肠杆菌。

　　03、摇菌，准备合适浓度的质粒。

　　04、制作枯草芽孢杆菌感受态细胞，将质粒转入不同的枯草芽孢杆菌宿主中，涂平板，37℃培养过夜。

　　05、挑单克隆并进行筛选鉴定。

　　06、针对不同的表达载体，采用不同的蛋白表达方式进行表达，获得目的蛋白。如转化pHT43表达载体，获得阳性克隆后，37℃培养至OD600=0.8-1.0，添加0.1mM IPTG诱导剂进行不同时间温度条件的诱导表达，取样分析做表达测试。

　　07、蛋白纯化测试，选择最优表达条件进行200ml表达纯化测试，估算蛋白得率。

　　08、放大及纯化，依据最佳条件表达纯化目标蛋白。

　　09、交付蛋白。

　　操作过程中，一起看看你有木有碰到这些问题

　　报告，你骗人!明明按流程操作的，结果。。。What are you 弄啥嘞!!!

　　小主息怒，因为整个表达系统的操作过程中存在诸多影响因素，把你遇到的问题交给我们，逐一为你解决。

　　那么问题来了。用液体LB培养的枯草芽孢杆菌，为什么都有块状沉淀一样的东西，感觉是菌体粘在一起了，是正常现象吗?

　　枯草芽孢杆菌在发酵后期会产生类似物质，跟浓度无关。室温静置久了，就会在培养基表面产生一层菌膜。

　　枯草芽孢杆菌的转化，常用的转化方法包括电击方法、原生质体和化学方法，哪种转化效率高?

　　通常情况下电转的效率要比其他效率高，但是也要考虑其他因素。野生型枯草菌由于自身有很强的修饰系统，比较难转化。

　　把平板上培养的枯草芽孢杆菌接种到液体培养基中，在摇床中培养。但是摇床中有别的菌，枯草芽孢杆菌是否会污染到别的菌?

　　操作严格，封口良好的话，不会污染别的菌。夏季室温较高，适合细菌繁殖，较容易发生芽孢杆菌的交叉污染，需注意无菌实验操作规范。

　　转化菌在抗性板上长出了单菌落，PCR验证质粒转化成功，接着摇瓶培养发现只在无抗培养基中长，有抗的没长，怎么回事?

　　可能原因：质粒不稳定;抗生素倒的平板不均匀;PCR的结果是假阳性。

　　怎样分析处理枯草芽孢杆菌表达情况?

　　针对胞内表达，直接超声破碎获得上清和沉淀进行分析;针对胞外分泌表达，可以采用TCA的方法4度沉淀过夜浓缩，或带有相关标签树脂进行快速纯化分析培养基中的蛋白，同时分析胞内蛋白。

　　你们有哪些配套的表达菌株及载体?

　　普健生物目前有：(1)适用于胞内表达的菌株168,1012及AS1，相关表达载体有pHT01和pHT254;(2)适用于胞外表达的菌株WB800N，相关表达载体pHT43。