关于质粒抽提的常见问题，你知道 哪些？

　　1、提不出质粒或者质粒提取量很少

　　(1) 菌体中无质粒：有些质粒本身不能在某些菌种中稳定存在，经多次转接后有可能造成质粒丢失。例如柯斯质粒在大肠杆菌中保存不稳定，因此不要频繁转接，每次接种时应接种单菌落。另外，检查筛选用抗生素使用浓度是否正确。

　　(2) 质粒拷贝数低：由于使用低拷贝数载体引起的质粒DNA提取量低，可更换具有相同功能的高拷贝数载体。

　　(3) 菌种老化：若是甘油保藏菌，需要在活化后再培养摇菌;建议涂布平板培养后，重新挑选新菌落进行液体培养。

　　(4) 吸附柱过载：不同产品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的质粒量很大，请分多次提取。若用富集培养基，例如TB或者2×YT，菌液体积必须减少;若质粒或宿主菌是非常高的拷贝数或生长率，则需调整LB培养液体积。

　　(5) 碱裂解不充分：使用过多的菌体培养液，会导致菌体裂解不充分，可减少菌体用量或增加溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的用量。对低拷贝数质粒提取时，可加倍使用溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，有助于增加质粒提取量和质粒质量。

　　(6) 溶液使用不当：溶液Ⅱ和Ⅲ在温度较低时可能出现浑浊，应置于37 ℃保温片刻直至溶解为清亮的溶液，才能使用。

　　(7) 洗脱液加入位置不正确：洗脱液应加在硅胶膜中心部位，以确保洗脱液会完全覆盖硅胶。膜的表面，达到最大洗脱效率。

　　(8) 洗脱液不合适：DNA只在低盐溶液中才能被洗脱，pH洗脱效率取决于pH值。最大洗脱效率在pH 7.0-8.5之间。当用水洗脱时确保其pH值在此范围内，如果pH过低可能导致洗脱量低。洗脱缓冲液加热至60℃后使用有利于提高洗脱效率。

　　(9) 洗脱体积太小：洗脱体积对回收率有一定影响。随着洗脱体积的增大回收率增高，但产品浓度降低。为了得到较高的回收率可以增大洗脱体积。

　　(10) 洗脱时间过短：洗脱时间对回收率也会有一定的影响。洗脱时放置1 min可达到较好的效果。

　　(11) 乙醇残留：漂洗液洗涤后应离心尽量去除残留液体，树脂型试剂盒漂洗后应晾干树脂，再加入洗脱缓冲液。

　　(12) 质粒未全部溶解：洗脱溶解质粒时，可适当加温或延长溶解时间。

　　2、质粒纯度不高

　　(1) 混有蛋白质：不要过多使用菌体。溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ处理并离心后，溶液应为澄清的，如果还混有微小蛋白质悬浮物，可再次离心去除后再进行下一步骤。

　　(2) 混有RNA：RNase A处理不彻底，请减少菌体用量或加入溶液Ⅲ后室温放置一段时间。如果溶液Ⅰ已保存6个月以上，要及时向Ⅰ中添加RNase A。

　　(3) 混有基因组DNA：加入溶液Ⅱ、Ⅲ后应温和混匀，若剧烈震荡，可能把基因组DNA剪切成碎片混在质粒中。如果加入溶液Ⅱ后过于黏稠，无法温和混匀，请减少菌体用量。细菌培养不要超过16 h，时间过长会导致细胞和DNA的降解。

　　(4)溶液Ⅲ加入时间过长：溶液Ⅲ加入后，放置时间不要太长，否则有可能产生小片段DNA污染。

　　(5) 宿主菌含大量核酸酶：宿主菌含大量核酸酶，在质粒提取中降解质粒DNA，影响提取质粒DNA的完整性，最好选用不含核酸酶的大肠杆菌宿主菌，例如DH5α和TOP10。

　　(6) 裂解时间过长：加入溶液Ⅱ后裂解时间不宜超过5 min。

　　(7) 质粒的二聚体和多聚体形式：是质粒复制过程中形成的，与宿主菌相关，电泳可检测出。

　　3、质粒浓度的检测

　　DNA纯度的判断大多根据OD260/OD280的比值检测，符合要求、纯度高的DNA样品其OD260/OD280在1.8-2.0之间，低于此范围表明蛋白质含量超标，高于此范围表明样品中含有RNA。

　　DNA的纯度也可以根据OD260/OD230的比值判断，OD230主要评估样品中是否存在一些有机污染物，如碳水化合物，多肽，苯酚等。纯度较高的DNA样品OD260/OD230的比值在2.0-2.5之间，比值小于2.0则表示存在有机物的污染，比如乙醇或者酚类残留。如果遇到此种情况，可以再沉淀一次，然后重复乙醇洗涤的过程。