什么是哺乳动物细胞展示技术？它的应用有哪些？

　　想要了解哺乳动物细胞展示技术，我们首先需要知道它的发展史。
　　1975年英国科学家Milstein和Kohler发明的杂交瘤技术将单克隆抗体正式带入人们视野。从1986年FDA批准了第一个用于治疗的单克隆抗体到如今，经过30多年的积累，单克隆抗体的研发已经进入了黄金时期。仅2017年一年，FDA和EMA批准的单克隆抗体药物就多达10个，为历年最高，而全球累积获批单抗类药物也已达到了73个。

　　单抗药物的研发技术和平台正日渐成熟，其中通过重组抗体的方式在体外进行抗体文库的构建及筛选已成为单抗药物研发的重要手段。由重组抗体技术分离产生抗体原理上模拟了体内抗体产生的过程：通过克隆多样化的抗体基因，基于不同的展示技术，体外表达抗体基因，将其基因型与表现型偶联，构建出具有多样性的抗体文库，再施加选择压力筛选出与靶蛋白特异性结合的单克隆抗体。

　　在重组抗体的应用中，常见的展示技术包括噬菌体展示技术、核糖体/mRNA展示技术、酵母表面展示技术、杆状病毒表面展示技术等等，其中大部分的展示技术都是基于原核表达系统，而这些技术大多只能展示小分子片段抗体，如抗原结合片段(Fab)，单链可变区抗体片段(scFv)等，无法展示并筛选全长抗体，且在原核表达系统中，表达蛋白过程中选择的密码子与真核细胞不同，故用原核表达系统筛选获得的全长抗体可能无法在体内获得高表达。而利用哺乳动物表面展示技术，可有效的解决在原核表达系统中出现的问题。

　　哺乳动物表面展示技术的优势

　　这种技术不仅能够展示全长抗体，还能够利用真核表达系统指导蛋白质的正确折叠，提供复杂的N型糖基化和准确的O型糖基化等多种翻译后加工功能，因而展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子，并在哺乳细胞中稳定且高水平的表达分泌。因此哺乳细胞展示技术具有其他技术没有的潜在优势。

　　拿最常见的噬菌体展示技术与之比较，如图所示：

　　同噬菌体展示技术一样，哺乳动物细胞表面展示技术也主要包括两个部分：一，构建哺乳细胞表面展示的抗体库;二，与靶标特异性结合抗体的富集及筛选。

　　接下来是对这两大关键步骤的详细解读！

　　一、构建哺乳细胞表面展示抗体库

　　构建哺乳细胞表面展示库有两种方法将重组DNA序列转入哺乳动物细胞中，一种是利用质粒转染，另一种是利用病毒感染宿主菌，包括牛痘病毒，慢病毒等。

　　1通过质粒介导的文库构建

　　目前invitrogen 推出了一款商业化的哺乳细胞展示质粒载体：pDisplay

　　为了在细胞表面展示抗体，该质粒将外源抗体DNA融合到了人类血小板生长因子受体(PDGFR)的跨膜区域。该载体上还包括了胞病毒启动子、小鼠Ig的信号肽、抗性筛选基因和c-myc标签。其中我们利用scFv羧基末端的c-myc标签来测量抗体的表达水平。人们可将外源基因克隆至载体的多克隆位点，再把质粒转染至哺乳细胞中进行抗体表达。

　　pDisplay载体主要功能如图下所示：

　　2通过病毒介导的文库构建

　　以慢病毒为例，如下图：

　　一般来说，慢病毒介导的外源DNA表达需要三种质粒：表达载体，包装载体和pVSV-G质粒。其中pVSV-G在胞病毒启动子的控制下表达VSV-G蛋白(水溶性口炎病毒)，VSV-G可以与细胞膜磷脂成分相互作用，促进病毒和细胞膜的融合。VSV-G不需要细胞表面受体，可以替代病毒包膜蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。

　　二：与靶标特异性结合抗体的富集及筛选

　　不同于噬菌体展示，哺乳细胞表面展示利用细胞分选和细胞扩增来使目的抗体得到富集，然后利用FACs技术完成特异性抗体的筛选。

　　A细胞分选

　　除了常规的流式细胞分选(FACs)外，免疫磁珠分离技术(MACs)也被用于带有目的抗体的哺乳细胞的分选富集。其策略如图所示：

　　免疫磁珠法分离细胞基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，在外磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。免疫磁珠法分正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。正选法-磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞;负选法-磁珠结合的细胞为不需要细胞。一般负选法分选较为常见，因为此方法获得的所需要的细胞表面不含有抗体及磁珠的干扰。

　　B目的抗体的富集及筛选

　　带有目的抗体的哺乳细胞经过多轮分选，扩增后获得了大量的富集。通过介导的质粒或者病毒颗粒将富集的目的抗体DNA转入表达抗体的哺乳细胞当中，稀释获得单细胞，经过培养，表达展示所得的单克隆抗体，再通过流式细胞检测，筛选得到与靶标蛋白特异性结合的单克隆目的抗体。

　　哺乳细胞展示技术虽然具有很多优势和开发潜力，但仍有不少问题有待解决。大部分哺乳细胞展示抗体库的库容多样性只有10^6-10^8，远低于噬菌体展示抗体库可达到的10^10-10^11，且操作难度较大，周期较长，成本也相对较高。在进行质粒转染或者病毒侵染的过程中，也较难保证只有一种外源DNA进入单个细胞，可能会对后期抗体筛选产生一定的干扰。但不管如何，哺乳细胞表面展示技术仍然是单克隆抗体筛选的一个重要手段。