如何使用TUNEL试剂盒?

　　前面，我们和大家聊过关于细胞凋亡的知识，今天，我们和大家具体聊聊有关于TUNEL试剂盒的具体使用方法。

　　1、样品预处理

　　细胞样品

　　细胞爬片或者细胞涂片经PBS洗涤后，4%多聚甲醛室温固定30分钟，PBS洗涤，再经终浓度为0.02 μg/μl的Proteinase K溶液通透5-10分钟;PBS洗涤3次，每次5分钟。

　　注意：细胞涂片要做好防脱处理。

　　组织切片

　　石蜡切片 (1)室温下将石蜡组织切片放入二甲苯中脱蜡10-20分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡10-20分钟。

　　(2)室温下用梯度乙醇(100%(Ⅰ)、100%(Ⅱ)、95%、80%、70%)各浸泡5分钟。

　　(3)PBS浸泡润洗切片，滴加终浓度为0.02 μg/μl的Proteinase K溶液通透15-20分钟。

　　(4)PBS洗涤3次，每次5分钟。

　　注意：这一步必须把Proteinase K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。

　　冰冻切片 (1)将玻片短暂回温后浸没在4%多聚甲醛溶液 (溶于PBS)中，室温孵育30分钟。

　　(2)PBS浸泡润洗切片，滴加终浓度为0.02 ug/ul的Proteinase K溶液通透10-15分钟。

　　(3)PBS洗涤3次，每次5分钟。

　　注意：Proteinase K帮助组织和细胞进行染色剂的通透，孵育时间过长会导致组织或细胞从切片上脱落，过短则造成通透性处理不充分，影响标记效率，为了得到最好的结果，可能需要优化通透时间。

　　2、阳性样本和阴性样本的处理

　　(1)根据实验要求设置阳性对照组和阴性对照组，按比例用去离子水稀释DNase I Buffer，配置1x的DNase I Buffer溶液，阳性对照组滴加终浓度为10 U/ml的DNase I缓冲液，实验组和阴性对照组滴加1x的DNase I Buffer使其完全覆盖，湿盒孵育10 min。

　　(2)去掉多余的液体，并将载玻片用去离子水彻底洗3-4次。

　　3、染色标记

　　(1)用去离子水按1:10稀释10x反应平衡液配置成1x反应平衡液。

　　(2)按照表格比例配置TUNEL检测液，每组切片滴加适量的TUNEL检测液使其完全覆盖(针对涂片、切片或者96孔板、48孔板、24孔板及12孔板，一般50 μl TUNEL检测液可足够用于大小约为2.5*2.5cm的样本)，室温湿盒避光孵育60分钟。

　　(3)将切片置于PBS或HBSS溶液中室温浸洗2次，每次5分钟。

　　(4)吸干切片上多余的水分，避免干片，滴加0.05 μg/μl的DAPI溶液，室温湿盒避光孵育10分钟。

　　(5)将切片置于PBS溶液室温浸洗3次，每次5分钟。

　　(6)用抗荧光猝灭封片剂封片。

　　4、观察检测

　　荧光显微镜下观察，激发波长范围450-500 nm，发射波长范围515-565 nm。

　　5、流式细胞术检测悬浮细胞

　　(1)将3-5×106个细胞用PBS洗2次，每次4℃，1500 rpm，离心10分钟。然后0.5 ml PBS重悬。

　　(2)固定细胞：加入1 ml 4%配制于PBS中的多聚甲醛溶液，冰上放置30分钟。

　　(3)4℃，1500 rpm，离心5分钟，去上清并且重悬于1 ml PBS。重复洗一次并用0.5 ml PBS重悬细胞。

　　(4)通透细胞：细胞可用配制于PBS中的0.1% Triton ® X-100溶液通透，室温放置5分钟，或者用0.1 μg/μl的Proteinase k溶液，室温放置5分钟。

　　(5)1500 rpm，离心5分钟，弃上清，细胞重悬于1 ml PBS。

　　(6)转移细胞至一个1.5 ml的微量离心管。

　　(7)1500 rpm离心5分钟，去上清并把沉淀重悬在80 μl 1x Equilibration Buffer (按1:10的比例用去离子水稀释10x Equilibration Buffer)中。室温孵育30分钟。

　　(8)细胞在1500 rpm离心10分钟，去上清并把沉淀重悬在50 μl TdT孵育缓冲液中。37℃避光孵育60分钟。

　　(9)直接加入DAPI染液，使其终浓度为0.05 μg/ml，避光室温孵育10分钟。

　　(10)用流式细胞仪分析细胞。测量495-520 nm的Fluorescein-12-dUTP的绿色荧光和364-454 nm的DAPI的蓝色荧光。

　　如上，就是关于TUNEL试剂盒使用的具体方式了，当然了，不同公司出产的试剂盒的操作方法在一些细节方面可能有一定的不同，所以，在使用之前，您可以先细读“产品说明书”，以避免问题的出现。如果您想了解细胞凋亡的知识，欢迎查看“什么是细胞凋亡?TUNEL细胞凋亡检测试剂盒的优点”。更多蛋白抗体知识，敬请关注武汉普健生物。