盘点WB中的一些常见问题

　　相信从事生物科技行业相关的各位“小小实验家”们都熟知WB，想起那些年在实验室被各种疑难杂症支配的恐惧，小普默默在线哭泣。为了让大家能够开心实验，文章无阻，今天小普来说一说：WB常见问题。

　　WB既蛋白质印迹法，是基于抗原抗体的特异性结合作用，以检测复杂样品中的某种蛋白，并对其进行半定量分析的一种方法。WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

　　WB的优点：灵敏，可达ng级，用Ecl显色法理论上可达pg 级，方便，特异性高。广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫遗传学。

　　WB结果常见问题分析

　　无目的条带

　　样本中所含目的蛋白表达量过低或无表达、抗体失活、蛋白转膜效率低、蛋白提取时降解、抗原无表达、试剂失效等。

　　细微弱带

　　上样量少、抗体浓度低、ECL 发光液失效等

　　高背景

　　封闭不充分、抗体孵育浓度过高、孵育时间过长或温度过高、洗膜不充分、显影时间过长、发光底物过度残留等。

　　非特异性条带

　　抗体特异性差，也可能样品量大，抗体浓度高。

　　白色空点

　　转膜时膜和胶之间有气泡、或者抗体孵育不均匀。

　　黑色斑点背景

　　封闭液颗粒残留。

　　条带拖尾

　　蛋白裂解不好、上样量过载、抗体孵育时间长、蛋白分辨率较低等。

　　条带扭曲

　　凝胶制备不均匀、凝胶中有气泡杂质、样本中盐离子浓度过高、电压过高等。

　　条带粘连成片

　　蛋白上样量过大、电泳中途停止时间过长样品弥散等。

　　条带大小与理论值不符

　　Mrker指示大小偏差、蛋白二聚体或多聚体形成、电泳体系的影响、蛋白氨基酸组成不同，某些蛋白所带电荷未能被带负电的SDS所覆盖，导致蛋白迁移率与蛋白大小不成正比等。