哺乳动物蛋白表达系统：从实验室到工业的精准“蛋白质工厂”

　　在生物制药与生命科学研究领域，​​哺乳动物蛋白表达系统​​因其能高效模拟人体蛋白质的翻译后修饰(如糖基化、磷酸化)和正确折叠，已成为重组蛋白生产的“黄金标准”。从抗癌单克隆抗体到新冠疫苗中的刺突蛋白，许多关键生物药与研究工具的背后，都离不开这一系统的支撑。本文将从技术流程出发，解析哺乳动物蛋白表达的核心环节与应用价值。

　　​​一、宿主细胞选择：搭建表达的“细胞工厂”​​

　　哺乳动物蛋白表达的第一步，是挑选合适的“细胞工厂”。常用宿主细胞各有特点：

　　•​​CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)​​：工业界的“主力军”，占全球治疗性单抗产量的70%以上。其优势在于遗传背景清晰、生长稳定、糖基化模式接近人类，适合大规模悬浮培养;

　　•​​HEK293细胞(人胚肾细胞)​​：实验室研究的“多面手”，转染效率高、增殖快，常用于病毒载体(如AAV、慢病毒)生产或短期蛋白表达;

　　•​​BHK21细胞(金黄地鼠肾细胞)​​：早期常用，但因潜在致瘤性风险，已逐渐被CHO和HEK293替代。

　　选择时需权衡目标蛋白特性(如是否需要复杂修饰)、生产规模(实验室小试vs工业量产)及成本(CHO培养基昂贵，HEK293更易转染)。

　　​​二、表达载体构建：为蛋白合成“编写蓝图”​​

　　载体是承载目标基因的“运输车”，需整合启动子、选择子、标签等关键元件：

　　•​​启动子​​：决定基因转录效率，常用CMV(广谱强启动)、EF1α(组成型表达，适合长期稳定株);

　　•​​选择子​​：用于筛选成功转染的细胞，如嘌呤霉素(puromycin)、G418抗性基因;

　　•​​标签序列​​：如His-tag(亲和纯化)、Flag-tag(WB检测)，或分泌信号肽(引导蛋白分泌至胞外，简化纯化)。

　　载体设计需避免序列重复(防重组)、优化GC含量(提升转录稳定性)，甚至引入“密码子优化”(适配宿主tRNA丰度)。

　　​​三、转染/感染：将“蓝图”送入细胞​​

　　将载体导入宿主细胞有两种主流方式：

　　•​​化学/物理转染​​：适用于HEK293等易转染细胞。脂质体转染(如Lipofectamine)通过膜融合递送DNA，操作简单;电转则利用电流穿孔，效率更高但对细胞损伤大。

　　•​​病毒感染​​：适合需要长期、高表达的场景。慢病毒可将基因整合至宿主染色体，形成稳定细胞株;腺病毒则通过瞬时表达快速生产蛋白(如疫苗抗原)。

　　​​四、细胞株筛选：锁定“高产冠军”​​

　　转染/感染后，需从数百万细胞中筛选出稳定高表达的“精英”：

　　•​​抗生素筛选​​：通过载体上的抗性基因(如puromycin)，仅存活的细胞携带目标基因;

　　•​​荧光分选(FACS)​​：若载体含荧光标签(如GFP)，可直接分选高表达细胞;

　　•​​单克隆化​​：通过有限稀释法或克隆环，获得遗传均一的细胞株，避免批次间差异。

　　​​五、表达与纯化：从细胞到高纯度蛋白​​

　　筛选出的细胞株进入“生产阶段”：

　　•​​表达条件优化​​：调整培养基(如无血清培养基降低成本)、温度(37℃或30℃减缓降解)、CO₂浓度(5%模拟生理环境);

　　•​​纯化策略​​：根据蛋白特性选择层析技术——亲和层析(如Ni-NTA纯化His-tag蛋白)快速富集，离子交换层析(Q/SP柱)去除电荷异质物，凝胶过滤(SEC)修正聚集。

　　​​六、鉴定与检测：确保“蛋白身份”无误​​

　　纯化后的蛋白需通过多重验证：

　　•​​SDS-PAGE/WB​​：确认分子量、纯度(>95%)及特异性;

　　•​​质谱(MS)​​：精确测定氨基酸序列，验证无翻译错误;

　　•​​活性检测​​：如酶活测定(比色法)、受体结合实验(SPR)，确保功能与天然蛋白一致。

　　​​七、应用：从实验室到临床的“最后一公里”​​

　　最终，这些“完美”蛋白将走向广泛场景：

　　•​​生物制药​​：如利妥昔单抗(抗CD20单抗)、阿达木单抗(抗TNF-α单抗)，均由CHO细胞表达;

　　•​​基础研究​​：作为抗原制备抗体，或用于信号通路研究(如STAT3磷酸化蛋白);

　　•​​疫苗开发​​：新冠重组蛋白疫苗(如智飞生物)的抗原，即通过HEK293表达并纯化。

　　尽管哺乳动物表达系统已趋成熟，挑战仍存——如细胞培养成本高、病毒污染风险、糖型调控复杂。但随着无血清培养基普及、自动化生物反应器应用，以及AI辅助的载体设计(如深度学习预测最优启动子)，这一系统正变得更高效、更可控。未来，它或将继续主导高端重组蛋白生产，为精准医疗与生物经济注入更强动力。