噬菌体展示技术-抗体药物开发的加速器

　　抗体是机体免疫系统的重要效应分子，其结构多样，可特异识别抗原，并且自身之间可相互识别。抗体在现代医学中起着重要的作用，被广泛地应用于实验室研究、疾病的诊断与治疗。

　　01、抗体技术发展的四个阶段

　　第一代：杂交瘤单克隆抗体技术;

　　第二代：嵌合抗体和人源化改造单克隆抗体技术;

　　第三代：全人重组抗体技术;

　　第四代：天然全人重组抗体技术。

　　过去由于均质性的全人重组抗体通过传统的制备方法很难大量获得，限制了抗体的大规模临床应用。而90年代初发展起来的噬菌体抗体库技术为制备全人重组单抗提供了可能。

　　02、噬菌体展示技术优势

　　噬菌体抗体将基因型和表型统一于一体，将选择能力与扩增能力结合起来，具有强大的筛选能力，能够在体外模拟体内的抗体生成过程，可以不经杂交瘤途径，甚至不经过免疫就可以制备和生产单克隆抗体。

　　与传统抗体技术的比较

　　噬菌体展示技术已被广泛用于世界范围内抗体的研究和开发，其发明者George P. Smith和Sir Gregory P. Winter于2018年凭此获得诺贝尔化学奖。

　　噬菌体展示技术原理

　　噬菌体展示技术的出现为全人重组抗体提供了一条简便、快捷的基因工程抗体制备路线，是全人重组抗体制备发展史上重要的转折点。

　　抗体库是编码特性未知抗体的抗体基因的巨大集合(通常大于1010)。抗体库是通过噬菌体展示和其他体外选择技术来发现抗体的重要来源，其设计是成功发现抗体的关键。

　　03、噬菌体抗体库的分类

　　随机肽库：

　　将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体的表面蛋白基因融合，在噬菌体表面表达出各种氨基酸组合的随机序列短肽。利用噬菌体展示随机肽库可以高通量筛选各种抗原的抗原表位。

　　免疫库：

　　免疫库由经过免疫(包括疫苗注射、微生物感染、自身免疫疾病、肿瘤等)后的供体B淋巴细胞的抗体基因构建。对于特定免疫抗原的抗体淘选的效率较高，但一般仅适用于一种特异性抗体的选择，库容量要求不高，一般106-108的库容量就可满足需要。

　　天然库：

　　采用不经免疫的人或动物来源的外周血淋巴细胞、骨髓、脾细胞的B细胞作为材料，进行基因扩增，但亲和力通常较低。骨髓内和骨髓外所有抗体基因都包含在内，所构建的抗体库适用于所有抗原所对应的抗体的选择，库容量要求较高，最小需要达到109，因为目前估算的自然界的抗原种类在这个数量级上。

　　噬菌体展示筛选抗体原理

　　04、噬菌体展示抗体药物研究进展

　　2002，阿达木单抗(Humira®)成为第一个通过噬菌体展示获得上市批准的全人重组抗体，连续多年成为全球药王。目前，噬菌体展示相继上市了9个抗体药物。随着最畅销的几个抗体药物专利相继到期，更多公司加速投身到抗体药物开发中，有大量通过噬菌体展示获得的全人重组抗体正处于临床研究阶段。

　　发现和研究一个好的抗体药物，首先需要一个优质的全人重组库。

　　已上市全人重组抗体药物

　　(噬菌体展示9个，转基因小鼠21个)

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　　05、噬菌体展示抗体库主要技术平台
　　06、千亿级全人重组抗体库

　　优势：

　　1. 序列正确性高，现阶段库容已达近千亿级别(1011 pfu)。

　　2. 两步法建库，先连入轻链再连入重链，将来自全世界不同地区人种来源的轻链和重链随机组合，保证了库的高质量和多样性。

　　3. 分为κ和λ两种轻链亚型的单链抗体库，与大多数商业化混合库不同，即可用于筛选κ型抗体，也可用于筛选λ型的高亲和力抗体。

　　4. 带有His标签，可直接用phagemid表达抗体，His标签纯化。

　　07、QC检测

　　1.总插入率及正确率

　　片段插入率100%，抗体序列正确率>86%。

　　2.抗体序列多样性分析

　　种系基因(Germline)分析：种系基因主要指单倍体生殖细胞和干细胞中所含有，未发生重排的全部基因。我们一般只分析抗体序列里面V基因的种系分布。

　　互补决定区(CDR)分析：抗体分子可分为恒定区和可变区两部分。在可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这个区域称高变区(HVR)。在L链、H链的V区中有三个高变区，该部位因在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，又称互补性决定区。

　　2.1种系基因分布特性

　　普健全人重组抗体库分为κ和λ两种轻链亚型，分析两种亚型轻链种系基因分布比例，及重链种系基因分布比例，表明普健全人重组库种系基因覆盖较全，分布特性符合抗体药物种系基因分布规律。

　　Κ型轻链种系基因分布比例

　　λ型轻链种系基因分布比例

　　重链种系基因分布比例

　　2.2 CDR3长度分布分析

　　通过对K和λ两种亚型库的克隆各随机挑选500个克隆进行测序分析，无重复序列。其CDR3长度分布符合正态分布，与全人重组抗体药物CDR3长度分布规律相符合。

　　Κ型轻链抗体CDR3长度分布比例

　　λ型轻链CDR3长度分布比例

　　重链CDR3长度分布比例