什么是蛋白定量？蛋白质含量的测定方法

　　蛋白定量即蛋白质定量，蛋白质定量根据其目的分为蛋白质的“总定量”和特定蛋白质的“个别定量”。蛋白定量是生物学实验不可缺少的一部分，为验证细胞裂解是否成功，或为了将多个样品进行平行实验比较或标准化保存，需对细胞裂解液进行蛋白定量;为了判定蛋白的产量，需对纯化好的蛋白进行定量;为了将纯化好的蛋白用生物素或报告酶进行标记，同样需要首先对蛋白样品进行定量，以保证标记反应在适当的化学浓度下进行。

　　蛋白质是一种十分重要的生物大分子，它种类繁多，结构不一，功能各异，分子量相差很大，因此建立一个理想而又通用的蛋白质定量分析方法很因难。

　　现测定蛋白质含量的方法有很多：根据物理性质来分有紫外分光光度法;根据化学性质来分有凯氏定氮法、双缩脲法、Folin-酚试剂法(Lowary法)、BCA法和胶体金法;根据染色性质有考马斯亮蓝染色法、银染法;根据其他性质有荧光法;其中较为常见的有以下五种。

　　1、紫外分光光度法

　　蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸具有吸收紫外光的性质，其吸收高峰在280 nm波长处，且在此波长内吸收峰的光密度值与蛋白浓度成正比，故可作为蛋白质定量测定的依据。该方法是最快的蛋白质定量方法，但由于各种蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量不同，如要准确定量则应有待测蛋白质的纯品作为标准来比较，或者知道其消光系数作为参考。另外，不少杂质在280 nm波长下也有—定吸收能力，可能发生干扰，其中核酸(嘌呤和嘧啶)的影响尤为严重。核酸的最大吸收峰是在260 nm，因此若溶液中存在核酸，必须同时测定OD260与OD280，然后根据两种波长的吸收度比值，通过经验公式校正，以消除核酸的影响而推算出蛋白质的真实含量。

　　优点

　　操作简便迅速，且不消耗样品(可以回收)，多用于纯化蛋白质的微量测定。

　　缺点

　　(1)当待测的蛋白质与标准蛋白质中的酪氨酸和色氨酸含量差异较大时，会产生—定误差。

　　(2)混有核酸时必须分别测定280 nm和260 nm两处的OD值，再按公式推算蛋白质含量。

　　2、双缩脲法双缩脲(NH3CONHCONH3)是两个分子脲经180℃左右加热放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能通过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10 mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。优点

　　较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。

　　缺点

　　灵敏度差，常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质测定。

　　3、考马斯(Comessie)亮兰结合法

　　考马斯亮兰结合法是近年来发展起来的蛋白质定量测定法。考马斯亮兰能与蛋白质的疏水区相结合，这种结合具有高敏感性，考马斯亮兰G250 的最大光吸收峰在465 nm，当它与蛋白质结合形成复合物时，其最大吸收峰变为595 nm。在一定范围内，考马斯亮兰G250-蛋白质复合物呈青色。在595 nm下，光密度与蛋白质含量呈线性关系。故可以用于蛋白质含量的测定。

　　优点

　　(1)操作简便、快速;检测灵敏;重复性好。

　　(2)显色迅速，约2分钟内可完成染料与蛋白质的结合，所现颜色至少在1小时内是稳定的。

　　(3)与改良Lowary法相比，干扰物质较少。

　　缺点

　　(1)当样品中存在较大量的SDS、TritonX-100等去垢剂时，显色反应会受到干扰。如样品缓冲液呈强碱性时也会影响显色，故必须预先处理样品。

　　(2)考马斯亮兰G250染液不宜久存，以1-2月为宜。

　　4、Lowary蛋白定量法

　　Lowary法是双缩脲法和福林酚法的结合与发展，其原理是：蛋白质溶液用碱性铜溶液处理，形成铜-蛋白质的络合盐，在加入酚试剂后，除使肽链中酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸等显色外，还使双缩脲法中肽键、碱性铜的显色效果更强烈。因此，Lowary法的显色效果比单独使用酚试剂强烈3-15倍，为双缩脲法的100倍。由于肽键显色效果增强，从而减小了因蛋白质种类引起的偏差。