什么是PCR?PCR引物设计的基本原则

　　20世纪后期发展的PCR技术改变了整个生物学研究的进程，其中引物设计的好坏直接关系到PCR的成败。

　　1引物设计的基本原则

　　引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。在某些情况下(比如构建文库)是在不知道模板序列的情况下进行引物设计的，这个时候引物核苷酸序列与模板不是完全匹配。我们通常的引物设计都是在已知模板序列的情况下进行，如下图1所示：

　　引物设计总体上包含三个程序：模板的获得、同源性分析以及引物筛选。模板的获得有多种来源，根据实验目的来定，这里不多作讨论。同源性分析的目的是看引物与模板有没有非特异性结合位点，特别要避免非特异性结合位点的3’末端完全配对。为最大程度确保获得较好的PCR结果，引物筛选需要满足以下几项基本原则：

　　01、引物长度：18-30 nt

　　大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸，引物长度的上限并不是很重要，主要与反应效率有关。引物越长，退火结合到靶DNA上形成稳定双链模板的速率越小。特殊情况下可以进一步延长到50-60 bp，但长引物的合成出错率高，价格贵，而且难以合成，因此较为少见。另外，上下游引物的长度最好基本相等，最多相差不超过3 bp。

　　02、引物GC含量：40-60%

　　A、T、G和C四种碱基要在引物中均匀分配，如果引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴。

　　03、引物的退火温度：55～75 ℃

　　退火温度需要比解链温度(Tm)低5 ℃，如果引物碱基数较少，可以适当提高退火温度，反之亦然。一对引物的退火温度相差4～6 ℃不会影响PCR的产率，但是理想情况下一对引物的退火温度是一样的。扩增产物的Tm值与引物的 Tm值相差不能大于10 ℃。

　　04、避免扩增模板的二级结构区域

　　用有关计算机软件可以预测目的片段的稳定二级结构，选择扩增片段时最好避开模板的二级结构区域。

　　05、引物末端不应超过3个连续的G或C

　　引物在G+C富集区容易错误引发，除在特殊的PCR(AS-PCR)反应中，引物3’端不能发生错配。如扩增编码区域，引物3’端不能终止于密码子的第3位，因为密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

　　06、引物不能形成二级结构

　　引物自身存在的互补序列会折叠成发夹结构从而影响其与模板的结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3 bp。两引物之间也不应该存在互补性，尤其应避免3’端的互补重叠以防止引物二聚体的形成。一般情况下，一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

　　07、为了后续操作而产生的不完全匹配

　　5’端对扩增特异性影响不大，因此可以被修饰而不影响扩增特异性，这些修饰包括：添加酶切位点、添加标记(生物素、荧光、地高辛和Eu3+等)、引入与蛋白质结合的DNA序列、引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。