干货篇：带你玩转基因定点突破

　　一般来说，在自然条件下基因突变是不定向且随机的，且突变频率极低，大多数是有害的。如镰刀型细胞贫血症等，因β-肽链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，构成镰状血红蛋白，取代了正常血红蛋白。

　　那如何利用基因突变去改变生物体原有的特性，促使其向有益于人类发展的方向呢?今天我们就来说一说基因定点突变。有目的性的在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，从而改变DNA序列中的碱基次序，称之为基因的定点突变。通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构。

　　1982年Zoller和Smith发表寡核苷酸介导的定点突变方法，该方法以M13噬菌体的DNA为载体，M13噬菌体最重要的特点是含有一种单链环形DNA，即正链DNA，当其感染大肠杆菌后，借助宿主的酶系统先把正链DNA转化成双链，然后进行DNA复制扩增。在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA，再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制。这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子，再经表达即可获得改造后的蛋白质。为了使目的基因的特定位点发生突变，所设计的寡核苷酸引物除所需的突变碱基外，其余的则与目的基因完全互补。此种方法保真度较高，但其缺点在于操作复杂，周期长，而且在克隆突变基因时会受到限制酶酶切位点的限制。

　　引物诱变的基本操作步骤：

　　1获得单链目的基因

　　2人工合成带突变序列的引物

　　3制备异源双链DNA

　　4转染宿主细胞

　　5筛选重组体

　　6突变基因的鉴定和回收

　　盒式定点突变

　　该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。如果将简并的突变寡核苷酸插入到质粒载体分子上，在一次的实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数。这种方法适合研究蛋白质分子中不同位点的氨基酸作用。缺点是在靶DNA区段的两侧需存在一对限制酶单切点，限制了该方法的广泛应用。

　　PCR介导的定点突变

　　在最初所建立的PCR方法中只要引物带有错配碱基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部分并不总在DNA的中间部分进行诱变。目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的任意部位产生定位突变。PCR介导的定点突变一般需要4种引物(1、2、3、4)，引物由带数字的箭头表示。突出部分代表错配碱基及 PCR 产物中产生的突变。图5中引物 1 和引物 3 互补, 引物 2 和引物 4 互补。两种单一限制性内切酶位点用于使质粒线性化。如要进行另外的单一特异位点的突变, 只需合成新的引物 1 和引物 3, 可用同一种经酶切割的模板。