昆虫杆状病毒表达系统-让大蛋白重组表达变得简单

　　IBEVS就是我们常说的昆虫杆状病毒表达系统，它是现阶段实现真核高效表达的系统之一。因为其不具有任何对哺乳动物有潜在致病性的动物病毒片段，所以，一经问世，得到了广泛的使用。而且杆状病毒通过细胞在获得重组病毒后，还能够继续在宿主细胞的昆虫幼虫以及蛹体内进行表达，极大地提高了效率。可以说，这是哺乳动物细胞表达系统以及其他表达系统难以实现的。

　　杆状病毒表达系统的优化过程

　　杆状病毒表达系统的发展其实也是一个曲折的过程。它最开始的应用也不是顺利且高效的，而是在科学家对其启动子、糖基化修饰等方面通过不断地改进后，才逐步称为如今有力的科学工具，最终服务于生命科学及医学领域。

　　什么是基因敲除技术？

　　1、敲除病毒中会影响到外源基因表达的chitinase或v-cathepsin，从而让分泌型重组蛋白得到更加有效的表达;

　　2、敲除病毒基因组上的p26, p10以及p74基因，能够有效提高重组蛋白表达水平，不过这个过程不会提高感染细胞的活力。
什么是糖基化改造？

　　其实就是把昆虫细胞中缺少的糖基化酶克隆到Bacmid上，使蛋白更加接近于哺乳动物细胞。

　　启动子、Kozak序列和UTR的优化：

　　P10或polyhedrin启动子已经属于强启动子，但通过对上下游相关序列的改造依旧进一步极大地提高外源基因的产量

　　抗凋亡Bacmid：

　　将靶向昆虫凋亡效应蛋白Caspase的小RNA序列克隆到Bacmid上，使病毒感染的昆虫细胞抗凋亡，从而提高外源基因的表达量

　　宿主细胞选择

　　杆状病毒表达系统中的宿主细胞多用草贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9、Sf12以及商品化的High FiveTM(Trichoplusia ni,Tn-5B1-4)

　　Bac-to-Bac的优势
　　1、由于重组病毒的分离是通过蓝白斑筛选，不存在野生型和非重组型病毒污染的问题，因此不需要传统繁琐的空斑分析来纯化重组病毒。

　　2、很大程度上缩短了重组病毒构建所需要的时间且重组效率达到100%。

　　3、外源基因在昆虫细胞内能进行正确折叠，表达出的目的蛋白结构上更接近天然蛋白，且具有完整的生物学功能。

　　4、昆虫细胞能对翻译后蛋白进行磷酸化、糖基化、酰基化、信号肽切除及肽段的切割和分解等加工修饰。

　　5、杆状病毒能容纳大分子的插入片段，能包装大的基因片段。

　　6、杆状病毒表达系统具备在同一细胞内同时表达多个基因的能力，既可采用不同的重组病毒同时感染细胞，也可在同一转移载体上同时克隆两个外源基因，表达产物可加工形成具有活性的异源二聚体或多聚体。

　　7、昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养，有利于大规模表达重组蛋白。

　　8、杆状病毒对脊椎动物无感染性，现有研究也表明其启动子在动物细胞中没有活性，因此在表达癌基因或有潜在毒性的蛋白时明显优于其他系统。