流式细胞术的发展及应用

　　流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)，顾名思义是一种研究细胞的技术，即利用流式细胞仪通过检测标记的荧光信号，对处在稳定、快速、直线流动状态中的颗粒性物质进行逐个、多参数的定性、定量分析或分选的技术。

　　研究对象：颗粒性物质，如大量的临床样本、外周血、骨髓、细胞穿刺液、洗脱液以及各种培养细胞、藻类、原生动物、病毒等生物性颗粒及人工合成微球等物理颗粒。

　　研究目的：通过流式分析研究颗粒性物质的特性，包括多种物理及生物学特征;通过利用不同荧光素标记不同组分将目的细胞与非目的细胞区分开来，从而获得纯度更高的目的细胞群并研究其物理及生物学特性。

　　技术特点：1.检测速度快;2.准确性好;3. 精确度高;4. 细胞不被破坏;5.灵敏度高;6.可进行多参数检测;7.不单限于表面抗原，可对发光度(如细胞体积)或荧光散射度(如DNA、RNA或蛋白含量、酶活性、特异抗原)来分离细胞。

　　01.流式细胞术的发展

　　流式细胞术是20世纪60年代后期开始发展起来的，流式细胞仪通过接受激光照射液流内细胞后的散射光信号和荧光信号反应细胞的物理化学特征，如细胞大小、颗粒度和抗原分子的表达情况等。主要应用于生命科学的基础研究，尤其是免疫学、细胞生物学和分子生物学。80年代后期开始应用于临床，辅助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。随后，利用流式分选干细胞过继回输用于疾病治疗，如NK细胞回输提高免疫力，CIK治疗等。

　　随着流式细胞术的发展，出现了多种型号的流式分析仪、分选仪，同时随着配备的激光器的不断升级，有些流式分析仪可进行多达10色以上的荧光分析。流式分析软件的不断优化，使得流式结果分析变得更加快速、便捷，并能简单获得多形式的流式分析示图，极大地丰富了生物学检测分析应用领域。这一集多个学科的智慧于一身，将计算机、电子工程、光学、流体力学、数学及有机化学等多学科巧妙地融合起来而诞生的流式细胞术在免疫学、发育生物学、细胞动力学、生理学、细胞生物学、分子生物学等生物学及医学研究的各个领域得到了广泛的应用，具有重大应用价值。

　　02.流式细胞术的应用

　　颗粒性物质的检测：

　　细胞外表--细胞表面分子的检测与分析等;

　　细胞内在--细胞内或细胞核内抗原检测与分析及细胞核酸分析等;

　　细胞状态--细胞凋亡与细胞增殖的检测与分析、单细胞水平胞内磷酸化蛋白的检测与分析等;

　　细胞及其细胞器功能--细胞毒、吞噬功能、胞内活性氧水平、细胞膜电位、细胞内钙离子浓度的检测与分析等;

　　细胞间相互作用--细胞融合的检测，荧光共振能量转移技术的应用等。

　　可溶性蛋白质分子的检测：

　　LEGENGplexTM多因子流式检测技术--基于微球的免疫检测技术，通过双抗夹心ELISA与流式技术相结合来定量检测可溶蛋白含量;

　　LabMAPTM液相芯片流式荧光技术--基于聚苯乙烯微球直径5.6μm，内部含有红色和橙色两种荧光染料，根据2种染料的比例不同可以将微球分成100多种，每种拥有一个编号，不同编号的微球被包被不同的探针分子，从而检测样品中的目的分子。可一次检测一个样本中的100多种目的分子;

　　CBA(Cytometric bead array)技术--利用人工合成的微球代替细胞，微球表面包被细胞因子抗体，利用荧光系统直接检测分泌到细胞外的处于游离状态的细胞因子。

　　03.常见的流式检测与分析应用

　　1. 细胞表面分子、胞内抗原的检测与分析

　　选择与荧光素偶联的抗体或使用一抗和与荧光素偶联的二抗，通过抗原抗体结合原理，实现检测细胞表面分子、胞内抗原表达量的目的，并可以作为一种抗体开发质控检测手段。

　　2.细胞DNA倍体与周期检测与分析

　　细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞，是细胞从2倍体到4倍体再分裂成2倍体的过程。

　　细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能(G0期)。由于细胞周期各时期的DNA含量不同，通常正常细胞的G1/G0期具有二倍体细胞的DNA含量(2N)，而G2/M期具有四倍体细胞的DNA含量(4N)，而S期的DNA含量介于二倍体与四倍体之间。

　　碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料。可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0，S和G2/M三期，从而可通过流式直方图对各时相细胞百分率进行分析。

　　3.细胞凋亡的检测与分析-Annexinv/PI复染法

　　细胞凋亡(Apoptosis)是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。通过流式细胞术分析，可快速准确的得到细胞处于早期、晚期凋亡的细胞比例，反映药物处理对细胞状态的影响。

　　在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素(EGFP、FITC)标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

　　Tips：Annexinv/PI复染法仅针对细胞未转染荧光质粒，如GFP、mCheery等及细胞本身无荧光干扰的体系。

　　4.胞内活性氧水平的检测与分析-DCFH-DA 单染色法

　　2′,7′-二氢二氯荧光黄双乙酸钠(DCFH-DA)为新一代ROS捕获剂，可迅速通过细胞膜进入细胞，在细胞内酯酶作用下脱去二脂生成不发荧光的2′,7′-二氯双氢荧光素(DCFH)，当细胞内存在H2O2，O2-等活性氧成分时，即被氧化成发荧光的2′,7′-二氯荧光素(DCF)，通过流式细胞仪测定细胞内DCF的荧光强度，即可对单个细胞为基础的细胞内ROS进行原位实时检测，从而根据荧光强度直接反映细胞内自由基的变化程度。

　　5.线粒体膜电位的检测与分析-JC-1染色法

　　线粒体与细胞凋亡密切相关，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。其中线粒体跨膜电位(△ψ)的破坏，被认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一，它发生在细胞核凋亡特征(染色质浓缩、DNA断裂)出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。细胞凋亡时，线粒体外膜的通透性、选择性增加使得细胞色素C等物质的释放，会导致线粒体膜电位的下降。

　　JC-1(5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzi-midazolcarbocyanine iodide)是一种阳离子脂质荧光染料，可作为检测线粒体跨膜电位的指示剂。JC-1有单体和多聚体两种存在状态。低浓度时，以单体的形式存在;高浓度时，以多聚体形式存在，两者的发射光谱不同。但均可在流式细胞仪绿色(Ex:488nm, Em:510/527nm)通道检测出绿色荧光，JC-1可透过正常细胞膜以单体状态聚集胞内，正常健康线粒体的膜电位(△ψ)具有极性，JC-1依赖于△ψ的极性被迅速摄入线粒体内，并因浓度增高而在线粒体内形成多聚体，多聚体发射光为红色荧光;可被流式细胞仪的红色((Ex:488nm, Em:580/590nm))通道检测到，而细胞发生凋亡时，线粒体跨膜电位被去极化，JC-1从线粒体内释放，红光强度减弱，以单体的形式存在于胞质内发绿色荧光。故而可以通过检测绿色和红色荧光来定性(细胞群的偏移)定量(细胞群的荧光强度)的检测线粒体膜电位的变化。因JC-1浓度的变化，在单体和多聚体之间形成一个可逆的转变过程。

　　6.细胞内钙离子浓度的检测与分析–Fluo-3/4染色法

　　Fluo-3/4是最适合应用于激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测的钙荧光探针之一。Fluo-3/4本身不能透过细胞质膜进人细胞内，但将其连接乙酰甲酯后形成Fluo-3/4/Am，后者可透过细胞质膜进人细胞内，再经非特异性酯酶脱去乙酰甲酯成为脂溶性的Fluo-3/4则可留在细胞内。

　　Fluo-3/4若以游离配体形式存在时几乎是非荧光的，但是当它与细胞内钙离子结合后可以产生较强的荧光，最大激发波长为494nm，最大发射波长为516nm，敏感性高。当用494nm波长激发时，其荧光强度与游离钙离子浓度成正比，据此敏感地测定细胞内钙离子浓度。