细胞转染之稳定细胞株的构建

　　细胞转染,简而言之，就是将外源分子(如DNA,RNA等)导入真核细胞中的一种技术。

　　分类：

　　瞬时转染(transient gene expression, TGE)和稳定转染(stable gene expression，SGE)两种。

　　瞬时转染

　　指外源 DNA或RNA 转入宿主细胞后不整合到宿主染色体中进行外源目的基因的表达。

　　特点：

　　1.目的基因未整合到染色体上，超螺旋质粒DNA有较高的转染效率;

　　2.转染24h-72h后常需要用到一些报告系统如荧光蛋白、β半乳糖苷酶等来帮助检测;

　　3.表达持续时间48-72h,随细胞分裂而稀释直至丢失;

　　4.用于快速分析:如基因产物短期表达、蛋白质小规模表达纯化。

　　稳定转染

　　指外源DNA转入宿主细胞后将外源目的基因整合到宿主染色体中进行表达。

　　特点：1.目的基因整合到染色体上，需要使用线性DNA(线性DNA虽然比超螺旋状的DNA转入量低，但整合率高);2.外源DNA整合到宿主细胞染色体中大约为1%，通常需要通过一些选择性标记反复筛选，才能得到稳定转染的同源细胞系。3.随宿主细胞基因组复制、转录、翻译，并被稳定遗传;4.用于获得稳定表达的外源基因的单细胞克隆：如大规模蛋白质的合成，长期的药理学研究遗传机制的研究等。

图1 细胞转染流程图

　　细胞转染的方法

　　物理法：电穿孔法、显微注射法和基因枪法;

　　化学法：磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、多种阳离子物质介导;

　　生物法：病毒介导转染、逆转录病毒、腺病毒。

图2 细胞转染的一些常见方法

普健稳定细胞株的构建

　　稳定细胞株：一般是将外源DNA克隆到具有某种抗性或者选择基因的载体上，载体被转染到宿主细胞并整合到染色体中，用载体中所含的选择标志进行筛选，筛选得到可稳定表达目的蛋白的细胞株。

　　服务内容

　　1. 基因过表达、突变、沉默等科研用稳转细胞株构建;

　　2. 重组抗体，细胞因子等生物药的稳转细胞系前期筛选。

　　技术流程及周期

　　1. 重组表达质粒构建(1周)

　　2. 药物本底浓度测定(2周，可与1同时进行)

　　3. 细胞转染(1天)

　　4. 多克隆稳定细胞株筛选及鉴定(2-3周)

　　5. 单克隆稳定细胞株筛选及鉴定(3-4周)

　　6. 稳转细胞株产量、活性检测及稳定性研究(根据客户需求)

图3 技术流程图

　　服务优势

　　高质：外源基因严格鉴定，细胞来源清晰，无污染

　　高产：重组蛋白/抗体表达量可快速优化至2g/L以上稳定表达

　　稳定：独有的GS稳转系列载体配合MSX药物筛选，实现稳定传代15代以上

　　快速：筛选高产细胞株，周期短至3个月

　　灵活定制：可针对重组蛋白/抗体全长或片段进行个性化表达

　　经验丰富：专业的技术团队，已成功为国内外多家医药公司和研究单位构建交付稳定细胞株

　　多筛选系统：G418/潮霉素/嘌呤霉素筛选系统，GS/DHFR 筛选孵化系统等