想要研究自噬，下面这些知识点你准备好了吗？

　　自噬是一个涉及到细胞自身结构通过溶酶体机制，负责将受损的细胞器、错误折叠的蛋白及其他大分子物质等运送至溶酶体降解并再利用的进化保守过程。

　　一、细胞自噬的基本概念及特征

　　1、自噬的过程

　　细胞质中的线粒体等细胞器首先被称为“隔离膜”的囊泡所包被,这种“隔离膜”主要来自于内质网和高尔基体;囊泡逐渐闭合最终形成双层膜结构,即自噬体，其大小约为 500 nm左右，囊泡内常见的包含物有胞质成分和某些细胞器如线粒体、内吞体、过氧化物酶体等;自噬体的外膜与溶酶体融合形成降解自体吞噬泡;由溶酶体内的酶降解自体吞噬泡中的内容物和内膜。

　　2、自噬的分类

　　巨自噬(Macroautophagy)：饥饿等刺激诱导下，胞质内产生双层囊泡结构包裹细胞器或长寿命蛋白形成自噬体，与溶酶体融合最终被降解的过程。

　　微自噬(Microautophagy)：溶酶体或液泡内膜直接内陷将细胞内物质包裹并将其降解的过程。

　　分子伴侣介导的自噬(CMA)：具有特殊模体的胞质蛋白被分子伴侣识别后，与溶酶体膜上的特殊受体——溶酶体相关膜蛋白Lamp2A结合，进入溶酶体被降解的过程。

　　3、影响因素

　　其影响因素包括：如饥饿、生长因子缺乏、微生物感染、细胞器损伤、蛋白质折叠错误或聚集、DNA损伤、放疗、化疗等等，均会造成细胞自噬产生。正常情况下，细胞自噬发生的概率很低，只有受到以上因素的影响时，自噬才会被激活，参与机体稳态调控。

　　二、细胞自噬信号通路

　　自噬的调控

　　依赖mTOR(哺乳动物雷帕霉素靶点)途径的自噬

　　(1)PI3K-AKT-mTOR信号通路

　　(2)AMPK-TSC1/2-mTOR 信号通路

　　其它的信号通路

　　(1)3-甲基腺嘌呤(3-MA)通过抑制Class ⅢPI3K的活性抑制自噬。

　　(2)beclin1和UVRAG作为正调控子，抗凋亡因子bcl-2作为负调控子共同参与组成Class Ⅲ PI3复合物调控自噬。

　　(3)GTP结合的G蛋白亚基Gαi3抑制自噬;GDP结合的Gαi3蛋白活化自噬。

　　(4)死亡相关蛋白激酶(death-associated protein linase,DAPK)和DAPK相关蛋白激酶(DAPK-related protein kinase-1,DRP-1)诱导自噬。

　　三、细胞自噬的研究方法

　　1.自噬体的观察

　　直接法：直接在透射电镜下观察自噬不同阶段的形态变化，由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。

　　① 初期，主要特征是成新月状，单层或多层膜

　　② 中期：双层或多层的液泡状结构即自噬体结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网

　　③ 后期：形成自噬溶酶体，单层膜，胞浆成分已降解

　　间接法：

　　①RFP-GFP-LC3双荧光标记

　　当自噬体与溶酶体未发生融合时，RFP荧光和GFP荧光都是存在的，当自噬体与溶酶体发生融合时，导致GFP淬灭，此时只能观察到红色荧光

　　②GFP-LC3单荧光标记

　　利用了LC3在自噬形成时聚集的原理,即无自噬时,GFP-LC3 融合蛋白弥散在胞浆中

　　③MDC染色

　　MDC是一种嗜酸性的荧光色素，由于能使所有的酸性泡着色，故为非特异性染色