蛋白折叠--现代分子生物学“皇冠上的明珠”

　　蛋白质作为一种生物大分子，是生物体的基本构成要素。蛋白质折叠是当今分子生物学的核心研究领域之一，它主要包括三个分支：折叠过程与机理的研究、蛋白质结构预测和蛋白质的结构与功能关系。蛋白质结构和折叠机理的研究依赖于蛋白质结构解析技术和变性复性实验。现在常用的蛋白质解析技术主要有两种：X 射线晶体衍射和核磁共振。

　　蛋白质的折叠是指一个蛋白质从它的变性状态转变到它的特定的生物学天然构象的过程。在这一过程中，除了二硫键之外，主要是氢键等一些非共价键的断裂和形成。近年来，许多实验手段被用来研究蛋白质的折叠过程，比如，各种光谱技术、质谱和核磁共振等。迄今，已积累了相当可观的动力学数据并出现了相应的蛋白质折叠数据库，为系统研究蛋白折叠规律提供了新的机遇。

　　揭示蛋白折叠机理是分子生物学领域的一大挑战，具有重要的理论和实践意义。在揭示生物大分子的运动规律，及蛋白质结构预测和工业用酶、农药医药的合理化设计方面都有重要的应用价值。

　　蛋白结构分类

　　我们通常把蛋白结构分为四类：一级结构、二级结构、三级结构和四级结构。从氨基酸到多肽，经折叠形成三维空间结构，从而发挥蛋白功能。目前，常用的蛋白质结构分类体系主要有两个：SCOP和CATH。

　　蛋白折叠机理研究

　　蛋白的折叠行为可以粗略地分成两类：两态折叠动力学和多态折叠动学。

　　对蛋白质折叠机理的认识大体经历了以下几个阶段：早期的(从一端开始的)“折叠核”模型，到层次折叠(碰撞扩散)模型，再到“折叠核凝缩”模型等。但关于蛋白折叠机理，目前学界尚未形成统一的认识。一个简单的模型或许不足以描述所有蛋白的折叠过程，蛋白折叠过程受多种因素影响。

　　蛋白折叠类型的决定因素

　　蛋白质的氨基酸组成和基于长程作用的三级结构拓扑复杂性，是蛋白质折叠类型的主要决定因素。当前的发现主要是基于对蛋白序列和天然结构(即蛋白的静态属性)的研究，要揭示蛋白折叠过程的细节，还依赖于对折叠中间体和过渡态结构的研究。

　　蛋白折叠预测

　　作为折叠过程的起点，蛋白质序列的属性原则上决定了蛋白折叠的动力学。

　　蛋白折叠过程模拟：通过计算机模拟蛋白从无结构的伸展状态到有结构的天然构象的折叠过程，既可以检验蛋白质折叠理论，也可以辅助蛋白质结构和功能设计，是蛋白折叠研究领域不可或缺的手段。

　　蛋白结构预测：作为蛋白折叠过程的终点，蛋白质天然结构的最直接预测方法就是蛋白折叠过程模拟。但受限于当前的计算能力，太大的蛋白则需要根据经验规则来预测蛋白结构。

　　此外，对于蛋白折叠过程相关参数及结构特征参数的预测，有助于蛋白折叠速率及结构形成机制的研究。

　　目前，蛋白折叠仍是一个十分活跃的研究领域。蛋白折叠与蛋白相互作用的偶联，与系统生物学研究的融合及理论在蛋白折叠和结构预测中的应用等，这些都是人们致力攻克的研究。

　　包涵体是由于蛋白异常折叠所引起的一种表达形式，对其应用价值，目前也还需要更多的探索。

　　包涵体(Inclusion Body)是外源基因在原核细胞中表达时，尤其是在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度(1.3 mg/ml)不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中其他成分有明显区别。

　　包涵体形成原因

　　在原核表达系统中，基因的转录和翻译是同步进行的，即边转录边翻译。蛋白折叠理论认为核糖体上翻译形成的多肽链从线性结构到天然高级结构的折叠过程中要经历一种中间体形式，因而翻译速率、折叠速率就在很大程度上影响了蛋白的表达形式。当蛋白的翻译速率远大于折叠速率时就容易形成不稳定或者错误折叠的空间构象，这样的蛋白或者被蛋白酶识别后降解，或者形成稳定的、不易被降解的聚集体，即传统意义上不溶的、无生物活性的包涵体;而折叠正确的蛋白就以可溶性形式存在。

　　实际上，蛋白在边合成边折叠的过程中由于完全或不完全的折叠形成了许多折叠中间态，包括天然构象的(图1中红色)、功能性亚单位(图1中绿色)和错误折叠构象的(图1中蓝色)，这种中间态即功能性包涵体。功能性包涵体不同于传统包涵体，它具有生物功能可以直接被应用或通过非变性条件提取活性蛋白。

　　包涵体形成原因

　　在原核表达系统中，基因的转录和翻译是同步进行的，即边转录边翻译。蛋白折叠理论认为核糖体上翻译形成的多肽链从线性结构到天然高级结构的折叠过程中要经历一种中间体形式，因而翻译速率、折叠速率就在很大程度上影响了蛋白的表达形式。当蛋白的翻译速率远大于折叠速率时就容易形成不稳定或者错误折叠的空间构象，这样的蛋白或者被蛋白酶识别后降解，或者形成稳定的、不易被降解的聚集体，即传统意义上不溶的、无生物活性的包涵体;而折叠正确的蛋白就以可溶性形式存在。

　　实际上，蛋白在边合成边折叠的过程中由于完全或不完全的折叠形成了许多折叠中间态，包括天然构象的(图1中红色)、功能性亚单位(图1中绿色)和错误折叠构象的(图1中蓝色)，这种中间态即功能性包涵体。功能性包涵体不同于传统包涵体，它具有生物功能可以直接被应用或通过非变性条件提取活性蛋白。

　　包涵体的优势

　　尽管外源蛋白质表达为不可溶形式的包涵体会造成后续处理困难，但包涵体的形成对于快速方便地纯化目标蛋白质具有很大的优势。具体体现在以下几个方面：

　　1.蛋白质的高水平表达，一般至少占据30 %的细胞总蛋白

　　2.快速方便的分离纯化方式

　　3.蛋白质稳定性高

　　4.有效防止被细胞内蛋白酶的降解

　　5.包涵体内目标蛋白的纯度高，甚至高达90 %，减少后续处理步骤。

　　事实上，由于上述优势，重组蛋白表达为包涵体已成为商业化蛋白生产的重要技术手段。对于一些需要蛋白免疫动物制备WB类用途的抗体实验来说，包涵体也是一个非常不错的选择。

　　由于包涵体没有生物活性，因此，一般地，包涵体首先溶解于高浓度的变性剂(如尿素、盐酸胍等)，同时添加一定量的还原剂(如β-琉基乙醇、二硫苏糖醇等);然后再通过降低变性剂浓度使多肽链折叠成活性蛋白质。在大多数情况下，从包涵体中回收的活性蛋白的总收率在15-25 %左右，这无疑会增加重组蛋白质的生产成本。因此，在包涵体蛋白的实际应用中其瓶颈在于如何高效率地将不可溶和无活性的蛋白转化为可溶且正确折叠的蛋白。