什么是标签蛋白？它的特点是什么？

　　现今蛋白质的结构和功能研究中，亲和标签系统是一个不可或缺的工具。标签的恰当使用可简化蛋白质的纯化过程、控制蛋白质的空间取向以及使体内生物事件可视化，提高重组蛋白的产量及纯度、增强重组蛋白的可溶性和稳定性等。根据自身分子量大小的不同，亲和标签可以分为两大类: 一类是结合固定化配基的短肽标签，如His-tag、FLAG-tag、Strep-tagⅡ等; 另一类是识别小分子配基的蛋白标签，如GST、MBP 等。而根据结合配基分子量大小的不同，亲和标签也可以分为两大类: 一类是与小分子配基结合的短肽或蛋白标签，如结合固定化金属的His 标签、结合固定化谷胱甘肽的GST 标签等; 另一类是与蛋白配基结合的短肽标签，如结合固定化钙调蛋白的CBP 标签等。

　　其中Flag标签系统是通过DNA重组技术将一个短的亲水性八肽(DYKDDDDK)融合到目标蛋白中，从而形成融合蛋白。Flag标签可位于蛋白质的C端或N端，该系统广泛运用于各种细胞类型中，包括细菌、酵母及哺乳动物等。Flag标签抗体能够特异性的与标签蛋白上的Flag标签结合，随之也被高频用于标签蛋白的纯化、定性定量检测蛋白表达水平、细胞内定位等实验。

　　Flag标签的作用原理

　　虽然Flag标签的序列简单，但是这八个氨基酸并非随意排列，其位置和序列与Flag的抗原作用密切相关。

　　1. Flag序列的第二个氨基酸是酪氨酸(Tyr)，属于芳香族氨基酸，芳香族氨基酸是抗原-抗体特异性反应的主要因素。

　　2. Tyr左侧与位于N端带负电的天冬氨酸(Asp)相连，参与抗原性位点的芳香族氨基酸在高极性环境中产生作用的可能性高于在低极性环境中，Asp可以辅助Tyr的抗原性。

　　3. Tyr下游的六个氨基酸残基( Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)形成一个六肽序列KDDDDK，这样的序列能形成高度暴露的三维结构，从而达到最大的亲水性，使Flag融合标签展示出很强的抗原性。

　　综上，Flag短肽以最短的形式高效地表达亲和标签的作用。

　　Flag标签的特点

　　1. 序列短小，仅由八个氨基酸组成，只用一条人工合成的寡核苷酸链就可以编码。

　　2. 结晶条件下Flag融合蛋白的构象与单纯目的蛋白的构象几乎完全相同，通常不会与目的蛋白相互作用，并且对目的蛋白的性质和功能影响很小，便于利用其对融合蛋白进行下游研究。

　　3. 融合有Flag标签的目的蛋白，可以直接通过Flag标签进行亲和层析，此纯化条件为非变性的，可以纯化得到活性的融合蛋白，并且纯化效率较高。

　　4. Flag抗体能够特异性的与标签蛋白上的Flag标签结合，可在 Western blot、Elisa等实验中对含有Flag的融合蛋白进行有效检测、鉴定。

　　5. Flag融合标签含有一个肠激酶(enterokinase)切割位点，肠激酶可以识别该短肽C端的五个氨基酸( Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)，通过肠激酶处理除去标签后即可获得天然的非融合蛋白质。

　　融合标签的切除

　　肠激酶：Flag-tag C端的5个氨基酸残基DDDDK是肠激酶的识别位点，该酶包含通过切割试剂所具有的大多数特征，活性高、适应pH范围广，在多种变性剂下和清洁剂浓度下均能使用，对其五肽识别位点有高度专一性识别并在识别位点的C端进行切割，留下没有多余氨基酸。

　　凝血酶：一种广泛用于切割标签的蛋白酶，凝血酶的最佳切割位点是X4-X3-P-P[K]-X1’-X2’,这里的X4和X3是疏水氨基酸，而X1’和X2’是非酸性氨基酸，一些经常识别的位点是L-V-P-R-G-S,L-V-P-R-G-F和M-Y-P-G-N。在X4-X3-P-R-G-X2’之间切割比在X4-X3-P-K-L-X2’效率更高。其他识别位点是X2-R[K]-X1’,这里的X2和X1’是甘氨酸，例如A-R-G和F-K-A，这里切割发生在第二个残基后。

　　Xa因子：Xa因子是一种较高效的去除融合标签的工具酶，可特异性识别I-E[D]-G-R-X1序列，并将融合标签从其C末端切除。