蛋白纯化方法多种多样，为何我们要用GST？

　　在蛋白研究中，想获得可溶性蛋白，我们会优先考虑GST融合蛋白表达系统。这是为什么呢?一起来看GST有哪些神通。

　　谷胱甘肽S转移酶(GST)

　　谷胱甘肽巯基转移酶(GST)是体内生物转化最重要的Ⅱ相代谢酶之一，是细胞抗损伤、抗癌变的主要解毒系统。GST是一个含有211个氨基酸的蛋白，通常将该蛋白加入到重组蛋白的末端以便对该重组蛋白进行纯化或检测。具有组氨酸的非融合蛋白会产生非特异性结合，这会阻碍组氨酸标签的亲和纯化。但GST标签则与之不同，由于GST对于其底物-谷胱甘肽具有极高的特异性，所以可以获得更高的纯度。

　　优点

　　增加外源蛋白的可溶性

　　适用范围广

　　可用不同的蛋白酶方便去除

　　高特异性，纯化方便且温和

　　提高外源蛋白的稳定性

　　保留了蛋白的抗原性和生物活性

　　缺点

　　分子量较大，可能会影响蛋白的功能和下游实验，纯化后需要去标签。

　　如果蛋白表达为包涵体，无法直接用GST标签纯化，可变复性后再进行纯化。

　　注意：可直接称取Reduced Glutathione粉末溶解在Equilibration/Wash buffer中，但是溶解后加NaOH将pH调至8.0。

　　下面介绍一下纯化GST标签蛋白的具体操作：

　　1、依据表达测试蛋白表达量选择合适体积的Glutathione Agarose (载量: 50 mg/ml)，用10 CV纯水将储存液中的酒精洗净，再用10 CV Equilibration buffer平衡;

　　2、将平衡好的Glutathione Agarose加入已过滤的细胞裂解液中，4℃(或室温)孵育至少1小时;

　　3、孵育后将裂解液加入亲和层析柱中，收集flow through，也可选择700 g，离心2 min，缓慢倒出上清液;

　　4、用10 CV Wash buffer清洗杂蛋白，最后一滴用Bradford检测，如果Bradford变蓝则应该适当增加Wash体积，直到Bradford检测不变蓝;

　　5、用Elution buffer将目标蛋白洗脱，用EP管分管收集，直到Bradford检测不变蓝;

　　6、洗脱完成之后用5 CV Elution buffer洗Glutathione Agarose，再用10 CV纯水洗，最后加20%酒精，保存在4℃冰箱。