什么叫做包涵体？盘点病毒包涵体形成的原因

　　包涵体(Inclusion Body)指的是外源基因在原核细胞中（尤其在大肠杆菌中）表达时，所形成的由膜包裹的高密度蛋白质颗粒（不易溶），我们在高倍显微镜下观察时，其为高折射区，和胞质中的其他物质呈现出明显的区别。

　　包涵体的50%以上都由重组蛋白组成，其余则为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白以及脂体、脂多糖等，一般只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。

　　包涵体的大小一般在0.5-1um之间，大肠杆菌中的包涵体直径一般在0.2 μm-1.5 μm之间。所以说，对于不同的蛋白质来说，其直径是各不相同的，比如干扰素的大小是0.811 μm，牛凝乳酶原的大小是1.281 μm。当然了，有些包涵体想对来说比较大，甚至其直径要大于大肠杆菌的直径，这样会造成大肠杆菌出现一个突起，这类包涵体可以通过光学显微镜看到。通常来说，一个细胞仅有一个包涵体。

　　当然了，还有一种叫做病毒包涵体。

　　这类包涵体是病毒在增殖的过程中，造成寄主细胞形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见，多为圆形、卵圆形以及不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成，少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。有的位于细胞质中(如天花病毒包涵体)，有的位于细胞核中(如疱疹病毒)，或细胞质、细胞核中都有(如麻疹病毒)。有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏(Guarnieri)小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏(Negri)小体。

　　细胞中的生物学活性蛋白质常以可溶性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质则会折叠成特定的三维结构型。但是对于包涵体内的蛋白来说，其为非折叠状态的聚集体，不具备生物学活性。

　　包涵体形成的原因

　　包涵体之所以会形成，主要原因是因为其与重组蛋白在表达的过程中，因为缺乏某些折叠辅助因子或者因为环境不适而无法形成正确的次级键有关。

　　1、表达量过高

　　据研究我们发现，在表达量较低的时候，包涵体的形成非常的少，而在表达量非常高的时候，则越容易产生包涵体。可能是因为在合成的过程中速度太快，导致其没有足够的时间对蛋白进行折叠，二硫键无法正确配对，造成过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。

　　2、氨基酸组成

　　一般来说，含有半胱氨酸越多的重组蛋白就越是容易形成包涵体，也就是说，脯氨酸的含量和包涵体的形成数量呈正比。

　　3、所处的环境

　　发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。

　　4、蛋白的来源

　　重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物蛋白翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。

　　包涵体形成的位置

　　蛋白包涵体的形成是一个非常广泛的现象，在大肠杆菌中，包涵体一般只会在细胞的两个位置出现：细胞质和外周胞质。无论出现在细胞内还是细胞外，都是由于中间体无法完成折叠所导致的。

　　包涵体在细胞内形成的位置和特点取决于蛋白表达的方式。

　　当大量表达时，三种不同的(天然的、含有OmpA信号肽的和完全切除天然信号肽的)内酰氨酶都会形成包涵体，前两者的包涵体一般在外周胞质，后者在细胞质内。这些包涵体的大小和形状有着非常明显的差别，这些差别主要表现在包涵体的形态、组分和多肽链构象上。

　　包涵体的纯化

　　包涵体的纯化主要有如下几个步骤：

　　1、收菌破碎

　　细菌发酵液高速离心收集菌体，经超声破碎或者裂解液处理后，高速离心收集沉淀。

　　2、洗涤

　　用低浓度的变性剂如2 M尿素在50 mM Tris ，pH 7.5条件下洗涤包涵体，除去包涵体上粘附的杂质，此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。该步骤一定要作用温和，过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解而无法粗纯将杂质分离。

　　3、变性溶解

　　一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。通常而言盐酸胍优于尿素，两者比较如下所示：

　　当然了，包涵体的存在有着其好处和坏处，但我们相信，随着结构生物学、生物信息学、蛋白质工程学及相关新技术和新设备的发展和完善，在不久的未来，预测和设计最佳复性方案将成为可能。普健生物展业为您提供重组蛋白表达服务，如果您有相关需求，欢迎来电咨询。