什么是Trizol？如何用Trizol法来提取RNA？

　　在我们进行基因的表达和调控时，通常需要从组织和细胞中去分离和纯化RNA。而RNA的质量高低，直接影响到cDNA文库的完整性、qRT-PCR和Northern Blot等，最终可以说，从根本上决定实验的成与败。

　　那么，什么是Trizol呢?

　　Trizol其是就一种RNA的抽提试剂，它里面含异硫氰酸胍等物质，能够迅速地破碎细胞，并抑制细胞释放出核酸酶。

　　RNA酶可以说是无处不在，而且其具有难以灭活的顽固本性，所以，我们在RNA的抽提过程中需要进行严格地控制，所用的试剂耗材，必须是通过RNase-free或DEPC处理过的。

　　之后，我们在实验步骤的各个阶段来进行剖析。

　　1、样品准备

　　01、RNA提取

　　将组织块放入到研钵中，加入少量的液氮，迅速研磨，在研磨期间需不断地加入液氮，以保证研磨环境，直到研磨成粉末状。每50-100mg组织中需要加入1 ml Trizol，转入1.5 ml EP管中进行后续操作。
　　组织的体积一般不要超过Trizol体积的10%，用匀浆器充分匀浆，致无明显颗粒后才停下，再转入到1.5 ml EP管中进行后续操作。

　　02、从细胞中提取总RNA

　　贴壁细胞去除培养基，用无菌PBS清洗细胞的表面，加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集到的样品置于RNase-free的离心管中，再-80℃环境下保存待用。

　　悬浮细胞收集细胞悬液，1000×g离心5 min，用适量的无菌PBS清洗细胞，1000×g离心5 min弃上清，沉淀加入1 ml Trizol，用带滤芯的RNase-free枪头反复吹打细胞，将收集的样品置于RNase-free的离心管中，冻存在-80℃冰箱备用。

　　03、从细菌中提取总RNA

　　对于细菌或蛋白质、脂肪、多糖或细胞外基质含量高的样品，还需要进行额外地分离。加入Trizol吹打混匀后，4℃，12000×g，离心10 min。将上清转移至新的RNase-free的离心管中，存在-80℃冰箱备用。

　　2、RNA提取

　　01、将冻存的RNA样本取出并在冰上解冻。

　　02、每管样本中都加入200 µl RNA专用的三氯甲烷(每毫升Trizol加200 µl)，振荡器震荡1 min后，并在冰上静置5 min。

　　03、4℃，12000×g，离心10 min。

　　04、此时液体分三层，将上层的水相转移到另一个RNase-free的离心管中。

　　05、加入等体积的-20℃预冷的RNA专用的异丙醇，上下颠倒混匀，于-20℃静置15 min以上。

　　06、4℃，12000×g，离心15 min，小心弃上清。

　　07、加入1 ml预冷的75%的乙醇(25% DEPC无菌水，75% RNA专用无水乙醇)涡旋混匀。

　　08、4℃，7500×g，离心10 min，尽量去除离心管中的残液，然后在无菌操作台中风干约10 min(注意不要过度干燥，否则难以溶解)。

　　09、每个离心管中加入适量的RNase-free的ddH2O溶解沉淀，用枪头吸打混匀，至完全溶解。离心几秒，让离心管中的液体全部在管底，然后置于冰上。

　　010、去除杂质DNA：

　　011、琼脂糖电泳检测RNA的完整性：建议使用DEPC处理的ddH2O配置1.2%琼脂糖凝胶，DEPC处理的ddH2O稀释TAE缓冲液。

　　*完整的RNA经凝胶电泳后会明显地观察到28S和18S两条带，并且28S的条带亮度约是18S的两倍。若两条条带不明显，则提示RNA可能部分降解。

　　*提取的RNA可用于后续操作，如需用qRT-PCR检测基因表达，为避免RNA降解，建议提完RNA后立即将RNA逆转录成cDNA进行保存，cDNA可在-20℃长期保存。

　　实验步骤就是这样，

　　但任何一步出现的问题

　　都可能让你的实验停滞不前。

　　所以，我们还需要了解：

　　常见问题及解决办法

　　01、RNA的各种吸光度代表什么?

　　260 nm、230 nm、280 nm下的吸光度分别代表了核酸、盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。OD260/OD280(R)体现了RNA中蛋白质等有机物的污染程度，质量较好的RNA的R值应在1.8-2.2之间。当R<1.8时，说明溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显;当R>2.2时，说明RNA已经被水解成了单核苷酸。

　　02、RNA提取量低怎么办?

　　① 加大起始的样本量。

　　② 向组织或细胞中加入Trizol之后，充分吹吸使样本充分裂解。

　　③ 加入三氯甲烷分层后，尽量完全回收上清。

　　03、提取的RNA不溶怎么办?

　　① 75%乙醇清洗沉淀后干燥时间不要过长。

　　② 可以于60℃加热5 min后再冰上溶解数小时。

　　③ RNA沉淀中含有不溶的蛋白质混合物时，应注意在相分离后吸取上清时，避免枪头接触蛋白层。