普健单抗干货篇：单克隆抗体制备小技巧

　　单克隆抗体技术的核心其实就是将骨髓瘤细胞(Myeloma Cell)和经特定抗原免疫刺激过的B淋巴细胞(Antigen Stimulated B Lymphoblast)相结合而成，所得杂交瘤细胞(Hybridoma Cell)。通过这个手段所产生的杂交瘤细胞不仅可以在体外实现无限增殖，并且还具备B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。因此，我们也常称单克隆抗体技术为杂交瘤技术(Hybridoma Technology )。

　　抗体是我们研究蛋白等生物大分子功能时常用的工具之一，其结构示意图如下：

　　抗体的应用在现阶段来说非常广泛，不过其生产过程也需要非常的精确。下面，我们结合实际情况，和大家分享单抗制备的五个阶段时需要注意的不同事项。

　　1、在进行抗原的设计和制备时，我们需要根据抗原的来源和性质决定，通常情况下，抗原可以分为：小分子、多肽及蛋白。所以，针对需求不同的抗体，我们需要搭配不同的抗原设计及筛选方案。

　　如果是用多肽作抗原，那么，该如何操作呢?

　　通常情况下，多肽序列需要尽可能地放在蛋白的表面;引物多肽序列亲水，而且芳香族氨基酸免疫原性较强;N，C端的肽段比中间的肽段更好;综合考虑后，所选择的多肽序列需要在不同物种中的同源性是否符合要求。

　　2、选择动物免疫时，我们通常选择小鼠来进行，因为骨髓瘤细胞(SP2/0)本身就来自于小鼠，用起来更加的方便。当然了，在这里我们需要注意三个问题：免疫部位、免疫周期间隔和免疫血清检测。

　　免疫部位

　　主要有皮下、腹腔、脾内、肌肉、腋下、脚垫、静脉。每只小鼠3-5个位点，免疫20-100 μg，免疫总体积100 μL。

　　免疫周期和间隔

　　第一次免疫和第二次免疫的时间间隔一般在2-3周，第三次和第四次免疫则每隔1-2周即可，最后一次冲击免疫一般在融合前的3天内进行，抗原则使用生理盐水或者PBS稀释，不加佐剂。最后一次免疫结束之后一周检测血清效价。根据血清效价，选择继续免疫或者细胞融合。

　　免疫血清检测

　　免疫动物的血清需要充分的实验数据来支持，之后才能进入细胞融合阶段。常规的实验数据包括：Elisa血清效价检测、内源裂解液WB/WB Block对比实验、IHC、ICC实验，或者根据项目应用设计血清检测方案。根据血清的检测结果可以判断项目的难易程度。

　　3、细胞融合细胞融合时间一般跨度都比较长，所以需注意如下两个问题。

　　01、无菌操作

　　每个实验室都需要建立完善的规章制度以及做好对新进实验人员的操作培训，确保整个实验过程中不出现污染。

　　02、sp2/0状态

　　重要性：Sp2/0的状态是决定细胞融合是否成功的关键因素。

　　方案：一般在融合前1天给sp2/0换液，将细胞密度调整到60-70%为最佳。

　　Tips

　　每年笔者所在实验室会将当前使用的sp2/0细胞进行亚克隆，挑选生长能力强的细胞株进行扩大培养。支原体检测阴性之后，冻存12支，每月使用1支作为sp2/0融合细胞株。

　　4、抗体筛选及亚克隆当融合的杂交瘤细胞经过HAT选择压力筛选生长起来之后，怎样快速得到目的克隆是整个实验的关键。实验的成败，有70%取决于筛选方案。

　　3个关键点

　　1.融合板每孔单克隆数控制在3个左右，如果每孔克隆数太多，容易造成亚克隆阶段目的克隆的丢失。

　　2.及时亚克隆，一般融合后第10天开始检测融合上清，从细胞融合到第一次亚克隆时间间隔不超过12天。

　　3.高效、合理的筛选方案。常见实验室抗体筛选方案主要有：Elisa、WB、IHC、FACS和IP。由于筛选通量的原因，一般Elisa会作为第1轮筛选的主要方案，后续筛选可以根据项目要求进行。这里需要注意一个问题，如果项目抗原是多肽或者小分子，血清检测效价不好的话需要考虑包被条件的优化，例如对包被浓度、包被时间、温度和包被缓冲液等进行优化。这些工作需要在血清阶段完成。免疫血清阶段检测数据决定了一个项目在抗体筛选阶段的结果。

　　5 抗体生产、纯化及鉴定抗体的纯化通常是浓缩抗体的最简单方法。尽管纯化抗体的方法较多，但protein A或protein G微球纯化法是最常用的方法。这种方法效率高，能为常用的实验方法提供足够的纯化抗体，而且随着商品化的蛋白A和蛋白G基质的出现，能将任何来源的抗体纯化。抗体的纯化也可采用传统的色谱法，在某些情况下非常有用。这些方法包括DEAE离子交换色谱法、硫酸铵沉淀法及其他方法。但是用蛋白G或蛋白A亲和柱法纯化较其他方法简单，并且纯化效果是其他方法的数倍。