大肠杆菌蛋白表达-从基因到克级蛋白表达解决方案

　　大肠杆菌是最早用于蛋白表达的细菌类产品，因为其遗传背景清晰，所得蛋白毒性小，使得其成为现阶段使用最为广泛的蛋白表达系统。那么，关于大肠杆菌表达系统，你了解哪些呢?下面，普健生物和大家具体盘点其一些相关问题。

　　Q1：大肠杆菌适合用来表达哪些蛋白?
 

　　大肠杆菌表达系统主要用于制备那些分子量小于80kDa且无复杂修饰的蛋白产品。比如：抗体片段、细胞因子、酶制剂等;

　　Q2：如何解决蛋白包涵体的问题?

　　一般来说，我们会通过三个方面来进行调整：

　　1、通过分子伴侣共表达，可以提升其30%的可溶性;

　　2、通过融合标签策略，通过标签，提升其可溶性;

　　3、通过低温诱导表达，从而降低其包涵体产生概率;

　　Q3：关于提升其高产发酵的参数有哪些

　　1、诱导时机。在实验室中，我们通常控制其OD600=0.6-1.0之间，工业级OD600控制在20左右;

　　2、溶解氧控制。实验室中通常不进行调控，而工业级生产需要将其饱和度调整到30%以上;

　　3、补料策略。实验室中通常一次性补料，而工业级通过指数流来进行葡萄糖添加;

　　4、单位产量。实验室通常在0.1-1g/l，工业就在5g/l以上;

　　Q4：为何优先选择pT7表达系统?

　　严谨调控：Basal表达低于lac系统10倍

　　超高强度：T7 RNA聚合酶效率提升50倍

　　兼容宿主：BL21(DE3)/HMS174(DE3)

　　Q5：内毒素要如何去除?

　　在不同阶段，去除内毒素的方法也是各不相同的：

　　1、细胞破碎阶段，可采用Triton X-114洗涤来去除内毒素，主要用于去除膜结合的内毒素;

　　2、蛋白纯化阶段，通过多步离子交换层析来去除内毒素;

　　3、终极处理阶段，通过吸附柱，来降低其内毒素;

　　Q6：表达过程中，如何实现二硫键的正确配对?

　　方案1：通过宿主改造。选用Origami系列

　　方案2：通过氧化环境。添加谷胱甘肽缓冲液

　　方案3：通过折叠验证。非还原SDS-PAGE+质谱鉴定

　　对于大肠杆菌表达系统来说，其主要用于表达那些结构不复杂且无复杂修饰的蛋白，容易实现大批量生产，从而满足一些蛋白类产品的需求。因为其制备成本低，而且技术需求也不那么严格，从而得到了广泛的使用。更多有关蛋白表达的相关知识，敬请关注武汉普健生物。

　　多克隆抗体制备-从免疫到应用的问题分析

　　我们知道，抗原通常由多个抗原决定簇组成，一种抗原则会刺激B淋巴细胞产生对应的抗体，这种抗体，我称之为单克隆抗体。而多种抗原簇则会产生式一种由多种单克隆抗体组成的混合物，这种混合物我们称之为多克隆抗体。

　　最早期的抗体因为抗原不纯，从而更容易制备出多克隆抗体，而随着技术的不断发展，抗原纯度越来越高，以及蛋白纯化方法越来越先进，单克隆抗体制备才得到了进一步的发展。今天，我们在这里，具体和大家聊聊多克隆抗体。

　　Q1：相比多克隆抗体来说，其和单克隆抗体存在哪些核心差异?

　　特性多克隆抗体单克隆抗体

　　​​靶点覆盖识别抗原多个表位仅单一表位

　　​​批次一致性需严格标准化免疫流程(CV<15%)克隆源性保证(CV<5%)

　　​​应用侧重诊断/检测/中和实验治疗/分子机制研究

　　Q2：如何保障多克隆抗体批次间的差异性?

　　其实，无论如何调控，批次间总会存在着一定的差异性，毕竟我们没办法完全调控出完全一致的环境。但是，却有办法来降低批次间的差异性。具体，我们可以从如下五个方面来进行。

　　1、抗原标准化。通过标准化的抗原生产技术，固定表达系统，保证抗原批次差异性更小;

　　2、免疫动物标准化。采用统一的品系、相同年龄及健康程度、同规格佐剂等;

　　3、效价监控。实时检测，采血，保证其表达效果;

　　4、混合血清。采用50只以上的动物混合血清;

　　5、纯化工艺。Protein A/G + 抗原亲和层析;

　　Q3：诊断用多抗如何避免交叉反应?​​

　　预吸附处理：用相似蛋白(如β-actin)吸附非特异抗体

　　正交验证：免疫组化/WB/ELISA三联检

　　表位定位：肽阵列扫描锁定特异性表位(如SARS-CoV-2 N蛋白C端)

　　Q4：多克隆抗体要实现大规模生产需要突破哪些瓶颈?

　　1、动物方面。需要采用模块化免疫舱，实现自动化采血;

　　2、产量方面。选择高滴度兔品系，提升其单次血清采集量;

　　Q5：未来技术发展方向有哪些?

　　1、核酸免疫。直接通过mRNA编码来代替动物免疫;

　　2、智能是额吉。预测免疫原性最优肽段;

　　3、无动物平台。B细胞筛选技术，实现无需动物免疫过程;

　　当然了，有关多克隆抗体制备的知识还有很多，还有着各种各样的问题等待着我们去解决。后续，相信多克隆抗体也能得到进一步的发展。更多有关多克隆抗体制备的知识，敬请关注武汉普健生物。

　　SPR技术-解锁抗体亲和力密码，精准提升药效

　　早些年，虽然蛋白表达能够满足很多方面的需求，但是，也隐藏着很多问题使所得蛋白无法满足需求。比如，某知名的PD-1抗体，就常常因为亲和力不足，而导致肿瘤清除率下降60%，从而造成临床上的惨败。而借助SPR技术，使得研究者能够在临床中准确把握这一风险，从而提高肿瘤的治疗效果。

　　那么，什么是SPR技术呢?

　　所谓的SPR的技术核心原理是：当抗体流经芯片固定的抗原表面时，引发等离子体波共振角偏移，实时动态监测结合/解离过程。

　　这项技术的颠覆式突破：

　　1、实时动力学：秒级捕捉结合速度(Kon)与解离速度(Koff)

　　2、无标记检测：保留抗体天然构象(vs ELISA强制标记)

　　3、超灵敏量化：检测限达pM级(1个抗体分子不漏过!)

　　SPR的优势体现在哪些方面?

　　1、全时程动力学监测。数据精准维度提升了10倍以上;

　　2、样品消耗下降。样品消耗小于1微克，检测成本下降了95%;

　　3、控制精度提升。温度控制精度下降到0.01摄氏度，重复性可能上升50%;

　　4、直接检测粗样。可以直接进行粗样检测，检测周期小于7天;

　　SPR技术未来发展方向：

　　1、人工智能整合。通过相关数据信息整合，预测抗体结合能力，减少80%以上的筛选过程;

　　2、活细胞检测。跳过纯化步骤，直接用来检测靶点结合力;

　　3、微型设备检测。手掌大小的设备，仅需几分钟就能检测出血清的Kd值;

　　SPR技术，可以说是推动蛋白表达的一大助力，能够有效提升蛋白的结合力，让蛋白药物的效果更佳。虽然说现阶段的检测复杂，而且费用相对较高，但是，相信随着技术的不断发展，这个检测过程将会变得更简单，相应的费用也会得到更好的控制。