不知IHC为何物？看完这篇就够啦！

IHC

是免疫组织化学（Immunohistochemistry）的简称，是以免疫学的抗原-抗体反应为理论基础，用标记的特异性抗体（抗原），对组织内的相应抗原（抗体）进行定位、定性和半定量检测，经组织化学显色反应，利用光镜、荧光显微镜或电子显微镜进行实验结果观察的一项技术。若该技术主要用于研究和观察细胞内的某些成分，又可称为ICC，即免疫细胞化学（Immunocytochemistry）。

研究对象

所有能作为抗原或者半抗原的物质，如蛋白质、多肽、核酸、酶、激素、磷脂、多糖以及病原体等，都可以成为它的研究对象。

其优势在于特异性高，敏感性高，方法步骤统一，形态、功能和代谢密切结合等方面。因此，IHC/ICC已成为临床病理不可或缺的辅助手段，尤其是根据该技术检测结果的表达水平所发展起来的相关“个体化治疗”方案，使免疫组化的质量及质控管理愈来愈受到高度重视。

IHC/ICC主要有四种基本类型

1

传统直接法新型直接法

原理

传统直接法将已知的特异性抗体与标记物结合，制备成标记抗体，再用标记抗体直接与标本内的相应抗原结合，光镜下观察抗原存在部位呈现特异性标记。

新型直接法采用一种具有惰性的多聚化合物（葡聚糖）为骨架，将特异性抗体和HRP结合在骨架上，形成HRP-葡聚糖-特异性抗体的巨大复合物，其内的特异性抗体直接与标本内的相应抗原结合，经酶促反应，即可在光镜下观察特异性阳性结果，也叫多聚螯合物酶法——EPOS法（Enhanced Polymer One-step Stainning）。

优点

传统直接法特异性强，非特异性反应较少，技术操作简便。

新型直接法敏感性极强，背景无染色，大大缩短了试验时间，是目前最简便的免疫组织化学方法，用于冰冻切片作用尤为突出。

缺点

传统直接法必须标记每一种特异性抗体，且只能检测一种抗原，敏感性较差，同时反应的信号也较小，特别是对于组织或细胞内微量的抗原检测。

新型直接法商品化的EPOS品种不多，试剂价格较昂贵。

2

传统间接法新型间接法

原理

传统间接法是用未标记的一抗与标本内的相应的抗原物质结合，用标记的二抗与一抗结合，通过荧光显微镜观察，或经过酶促反应后利用光镜观察有色的阳性反应产物。

新型间接法是将标本内的抗原与一抗结合后，标记有多聚化合物酶复合物的二抗与一抗结合，经酶促反应进行显色定位，也叫EnVision法。

注：EnVision复合物是由二抗分子的一个Fab段与HRP/ALP通过聚合技术结合在线状的葡聚糖上而形成。

优点

传统间接法一个一抗可以结合多个二抗抗体分子，增强了免疫反应信号，敏感性比直接法增大3-4倍；一抗使用浓度较直接法低；不用直接标记一抗，标记的二抗可以用于多种一抗。

新型间接法每一分子的EnVision复合物中约含有70个酶分子和10个二抗分子，具有高度的方法作用，也增加了与一抗分子的结合机会；机体内不存在这种葡聚物，背景非常干净；染色步骤分为两步，操作简便省时。

缺点

传统间接法特异性低于直接法，容易出现非特异性染色；染色步骤较多，染色所需时间延长。

新型间接法是目前最优化的方法。

3

酶桥法PAP法

原理

酶桥法是制备同种属的特异性一抗和抗酶抗体（三抗），利用二抗作为桥梁将三抗与一抗连接起来，三抗的标记酶经酶促反应，即可在抗原位置上呈现有色阳性反应产物。

PAP法则是借助二抗的桥梁作用，将PAP/ALP复合物连接在与组织抗原结合的一抗上。PAP复合物由3分子酶和2分子的抗酶抗体构成，抗酶抗体和一抗为同种属动物的IgG，经相应的酶促反应，可通过显微镜观察到阳性结果。

优点

酶桥法3种抗体均被酶标记，酶是通过免疫学原理被标记在三抗上，避免了因化学方式结合对抗体和酶活性的损害，提高了方法的敏感性，节省了一抗的用量。

PAP法抗体活性高，灵敏度高，背景染色低。

缺点

酶桥法标记的酶类很难被精确的稀释到恰当的浓度，以达到和三抗的抗酶部位全部结合，同时也难以彻底洗脱掉与标本中其他成分非特异性结合的酶，造成较高的非特异性染色。

PAP法染色步骤较多，需要的染色时间长。

4

ABC法SP法

原理

ABC法即抗生物素-生物素-过氧化物酶法，它的关键是ABC复合物，由一个卵白素分子结合3个生物素化的过氧化物酶分子构成。卵白素作为“桥”连接在生物素标记的过氧化物酶与生物素标记的抗体之间，于是形成一个含有3个以上过氧化物酶分子的网格状复合物，通过ABC复合物中卵白素与生物素化抗体结合，经过组织化学的酶显色反应，达到检测组织或细胞原位内抗原的目的。

SP法即链霉抗生物素-生物素法，与ABC法相似，不同的是链霉抗生物素蛋白与生物素化酶（HRP）结合，形成链霉抗生物素-生物素化酶复合物，这种复合物再与生物素标记的二抗结合，通过酶的显色反应检测抗原存在的部位。

优点

ABC法敏感性高（相对于PAP法），特异性强，尤其适用于单克隆抗体，组织背景染色浅，操作方法简便，节省染色时间。

SP法相比ABC法，有效地降低了内源性生物素带来的非特异性反应的程度，敏感性增加了4-8倍。

缺点

ABC法使用时某些器官或者组织内的内源性生物素与卵白素特异性结合，引起非特异性反应增强。

随着免疫组织化学各项技术的发展应用，相继建立了多种不同的标记抗体的方法，因而也就产生了与其相应的各种免疫组织（细胞）化学技术。根据标记物的不同，可以分为：免疫荧光组织（细胞）化学技术、免疫酶组织（细胞）化学技术、免疫铁蛋白标记技术、免疫金银标记技术、亲和免疫组织化学技术、免疫电子显微镜技术、杂交免疫组织（细胞）化学技术、免疫双重和多重组织（细胞）化学技术。

以上都是理论，

来看一点实际的。

操作流程

现从取材、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色和封固这9个过程详尽的介绍最常用的石蜡切片免疫组织化学技术。

标本取材

很重要！

取材是标本制备过程的第一步，取材是否科学，是否符合实验要求，将直接影响光镜下组织或细胞的形态学观察。

怎么做？

不论取材的标本来自何种途径，首先应尽量保证所取材标本的形态完整性和材料新鲜性。

为什么？

因为死亡两小时以上的标本，其组织或细胞将呈现出不同程度的自溶，有些抗原可能会出现变形、弥散和消失的现象。这些都不利于抗原抗体的结合，从而直接地影响免疫组织化学反应，导致实验结果的偏差。因此，取材要求准确、迅速和完整，以免因操作不当造成抗原破坏或丢失，影响实验结果的正确性。

举三个例子

活检标本/病理标本

对于病变部位大的标本，取材要具有代表性，在保证组织结构完整的情况下，可适当分割成为较薄的标本块，其中应包括：主要病灶、病灶与正常组织交界处、病灶周围的正常组织。

实验动物标本

根据实验目的和要求选择正确的动物麻醉方法或者处死方法进行取材。

细胞标本

不论是获取的新鲜细胞液，还是经过酶消化作用而制备成的细胞悬浮，都可以通过离心沉淀的方法使细胞浓缩成细胞团，吸出上清液。注意缓慢加入固定剂，不要将细胞团冲散。固定时间一般为1-6小时。

标本固定

用于标本固定的固定剂种类很多，不同的固定剂固定的标本适用于不同的实验目的，应根据检测物质的抗原性质、所使用的抗体特征以及固定剂的性质选择合适的固定剂。目前用于免疫组化实验的常用固定剂有以下几种。

10% 福尔马林缓冲液（pH 7.4）

10%甲醛溶液加入0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液90 mL，混合均匀，即为10%福尔马林缓冲液。

适用范围

该固定液广泛适用于标本的固定，既能有效的保护标本的组织或细胞形态结构，又能保持标本内的抗原活性，只是甲醛的交联作用会对某些抗原表面的抗原决定簇有一定的封闭作用，因此要在染色前对封闭的抗原决定簇进行暴漏，即抗原修复。常规大小的标本块，固定时间为12-24小时。

4% 多聚甲醛缓冲液（pH 7.4）

多聚甲醛40 g溶于0.01 mol/L pH 7.4 PBS缓冲液500 mL，搅拌加热至60℃，滴加1 mol/L氢氧化钠至溶液清澈，冷却至室温，最后补加PBS达总体积为1000 mL，过滤，即为4%多聚甲醛缓冲液，4℃冰箱保存。

适用范围

它对标本的渗透性较强且产生的收缩小，由于其pH近中性，可以最大限度的保存抗原的活性，由于该固定剂性质较为温和，于4℃保存较长时间的标本，仍可获得满意的实验结果。同时也适用于标本灌注固定，灌注后的标本再在此固定剂中浸泡固定6-12小时即可。

Bouin固定剂

在75 mL的饱和的苦味酸溶液中加入25 mL 10%甲醛溶液，再加入5 mL冰醋酸，混合后即为Bouin液。

适用范围

它也是形态学常用的固定剂，对于某些抗原的保存较10%福尔马林缓冲液更适合免疫细胞化学的研究。对标本的渗透性强，产生的收缩少，但其pH为3-3.5，对标本内的抗原可能有一定的损坏，因此标本不适合在固定剂中长期停留。

标本处理

脱水

透明

浸蜡

包埋

切片

详细步骤如下图所示

↓

最后两步

染色和封固

脱蜡：二甲苯，室温，两次，每次20分钟。

↓

水合 ：100%→100%→95%→90%→80%→70%乙醇→蒸馏水，每级5分钟。

↓

3%过氧化氢，室温孵育10分钟。蒸馏水冲洗。PBS浸洗5分钟。

↓

抗原修复。

↓

PBS洗涤3分钟，3次。

↓

封闭用血清，室温孵育10-30分钟，倾去血清，勿洗。

↓

滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育60-90分钟，或者4℃过夜。

↓

PBS洗涤3分钟，3次。

↓

生物素标记的二抗，室温30分钟。

↓

PBS洗涤3分钟，3次。

↓

ABC复合物，室温孵育30-60分钟。（ABC法）

or

辣根过氧化物酶标记链霉抗生物素，37℃或室温孵育10-30 min。(SP法)

or

辣根过氧化物酶标记抗兔/抗鼠IgG多聚体，室温30分钟。(Envision法)

↓

PBS洗涤3分钟，3次。

↓

显色剂（DAB)显色反应，5-10分钟。光镜下控制显色程度。蒸馏水洗终止显色反应。

↓

细胞核复染苏木素3-5分钟。流水冲洗蓝化。

↓

脱水：70%→80%→90%→95%→100%→100%乙醇，每级5分钟。

↓

透明：二甲苯2次，每次5分钟。

↓

中性树胶封固。

实验流程那么长，看得有点累了？

撑住！

还有更刺激的！

敬请欣赏

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