连细胞都养不好，你拿什么来养她？

多年以前，

孔子就说过

“唯女子与小人难养也，

近之则不逊，

远之则怨。”

其实他不知道，

那是因为

”女子“与”小人“身上

都有着同一种东西，

那就是

细胞!!!

”女子“与“小人”之所以难养，

是因为细胞很难养！！！

不信？

看我们星爷的表情。

↓

养细胞可不是

撒金钱花时间再加甜言蜜语

就可以搞定的。

也许你养了很长时间，

还是发现以下这种图

↓

永远都是别人家的！

 

没关系，

这里有绝招。

 

首先我们需要了解一下什么是

 

 

细胞培养技术

 

细胞培养技术实际上就是细胞克隆技术：模拟体内环境，在无菌条件下，给予适当的温度和酸碱度以及细胞生长繁殖所需的营养条件，使其能在体外维持生长繁殖并保持其结构和功能。

 

 

细胞培养技术的应用十分广泛，包括基础医学研究、抗体制备、新药筛选和基因工程等。

 

 

之所以做起来比说起来难，

主要是因为有一门技术特别关键，它就是：

 

 

 无菌技术

 

 

要掌握无菌技术，

需要注意以下几点：

 

细胞培养房应有一个单独的体系，所有细胞房使用的耗材试剂都应该是经过高温灭菌的。

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现在一般都直接购买无菌的培养基、血清、PBS、一次性的培养瓶和培养皿、一次性的离心管，这在一定程度上大大减少了培养细胞所耗费的人力和可能因为灭菌不彻底所带来的污染。

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实验人员应穿戴整齐帽子、口罩、洁净服、手套、鞋套才能进入细胞房。

超净工作台使用前应照射30 min紫外以消毒，尽量减少拿进超净台的物品，培养瓶或培养皿拿进超净台后可用酒精棉球擦拭，实验人员的手套也需要经常喷酒精以消毒。

实验过程中勤换枪头，一经污染立即丢弃。

实验结束后，移走所有物品，用消毒酒精擦拭工作台面并照射30 min紫外以消毒。

当天实验垃圾当天处理，不留在细胞房过夜。

 

无菌技术学到手以后，

以下几种就容易多了：

 

 

 

原代培养

 

原代培养是指从组织分离细胞之后至第一次传代之前的细胞培养阶段。此法用于分离并培养特定的所需要的细胞。

 

 

细胞复苏

 

细胞复苏是将冻存在液氮中的的细胞重新培养。

 

复苏流程​

冻存于液氮中的细胞在37℃水浴锅中快速冻融，吸到一个无菌的15 ml离心管中，加入4 ml培养基，1000 g离心5 min，弃去上清，加入5 ml完全培养基轻轻将细胞沉淀吹打均匀，再将细胞悬液吸取到一个新的无菌培养瓶/皿中，并补加适量培养基，推匀，置于二氧化碳培养箱中培养，隔天换液。

 

 

细胞传代

 

细胞培养到一定的时候需要换液和传代，以免营养成分不够影响细胞生长，或者因细胞生长过于密集而导致细胞出现衰退和分化。一旦细胞生长状态变差将很难扭转和补救。并且，每天都应该用肉眼观察培养箱水盘和二氧化碳压力表，培养基的颜色是否澄清透明，在显微镜下观察细胞形态和生长速度是否正常。一般贴壁细胞生长到85-90%就需要进行细胞传代了。

 

传代流程

 

弃去培养瓶/皿中的培养液，用无菌PBS洗2次，弃去PBS，加入适量胰酶，放入培养箱中孵育几分钟（不同细胞消化时间不一样），轻轻拍打使细胞完全脱落。立即加入含血清的培养基终止消化，并用一次性枪头轻柔的吹打均匀，将细胞吹打成单个细胞。此时的细胞悬液移到另一无菌15 ml离心管中，取100微升用于计数，其余的1000 g 5 min离心。离心结束后弃上清，在离心管中加入适量PBS重悬，得到的细胞悬液可用于细胞传代，细胞传代比例一般是1:3-1:5；或者根据计数结果铺板进行其他实验。悬浮细胞的操作方法同贴壁细胞类似，区别只是在于用15 ml或者50 ml离心管收集细胞悬液并离心和计数后即可对细胞进行传代或其他实验操作。

 

细胞计数流程

 

在100微升的细胞悬液中加入10微升的台盼蓝染液，混匀，取10微升加入细胞计数板中进行计数。4个大方格的细胞数除以4再乘以1.1再乘以10⁴，所得数值即为细胞密度。

 

细胞冻存​

 

细胞冻存和细胞复苏过程中对细胞伤害最大的是细胞内的水形成的冰晶，所以采取慢冻快融以尽量减少冰晶的形成。细胞冻存可以直接买商品化的冻存液也可自行配制。10%DMSO+90%FBS，混匀4度保存可放置一个月。

 

冻存流程

 

贴壁或者悬浮培养的细胞经胰酶消化成单个细胞后用含有血清的培养基终止消化，1000 g离心5 min，弃去上清，用PBS洗2次，最后在细胞沉淀中加入1 ml冻存液，重悬，并将细胞悬液加入到冻存管中，在冻存管的管壁上做好标记如细胞名称，时间，冻存人，将冻存管放入程序降温盒，置于-80℃，过夜后放入液氮罐即可。

 

 

常见问题

细胞培养最常见的问题是污染。

 

微生物污染

表现是培养液由澄清透明变浑浊，镜下观察可见异常不明颗粒或者菌丝体。对于发生微生物（细菌，酵母）污染的细胞除非是特别珍贵的细胞，否则一般不建议用抗菌药物杀灭细菌或酵母，应予以丢弃。若一定要保留被污染的细胞，则可用PBS反复洗涤，再加入抗菌药，并勤换培养液。注意与其他未污染的细胞所使用的东西分隔开，最好单独一个生物安全柜。

 

支原体污染

细胞突然变得生长速度缓慢或者死亡，悬浮细胞则发生聚集。支原体污染的细胞可用杀死支原体的药物处理，一般经过处理几天后情况会有所好转。

 

病毒污染

一般发生病毒污染的细胞很难被检测出来，不过即使有病毒污染也不会对实验结果产生影响，一般不必理会。

细胞培养避免污染的的重中之重在于预防。细胞房应每周彻底清洁一次，所用物品和耗材应严格灭菌，实验人员应严格无菌操作。