流式小课堂

简介

流式细胞术（Flow cytometry，简称FCM）是一种基于流式细胞仪通过检测偶联荧光信号快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞或者颗粒）的多项特性技术，同时可以对特定群体进行分选。早期流式细胞术主要用于定性，后续慢慢发展为多参数定性、定量以及分选的技术。

原理

其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。

液流系统

光溜系统

常见的流式细胞术应用

01

细胞群比例测定以及表型测定

运用流式细胞术测定某细胞群体或者细胞亚群的比例是其最基本功能。要完成细胞群比例测定我们需要明确：要测定的总体是什么，例如免疫细胞的特征表型是CD45,T细胞的特征表型是CD3，由此我们可以得到一群CD45+CD3+ 或者CD45+CD3-细胞，同理我们也可以对得到的这群细胞进行进一步划分，最终得到我们的目标细胞群比例测定或者是表型测定。

02

细胞表面分子、胞内抗原的检测与分析

选择与荧光素偶联的抗体或使用一抗和与荧光素偶联的二抗，通过抗原抗体结合原理，实现检测细胞表面分子、胞内抗原表达量的目的，并可以作为一种抗体开发质控检测手段。

03

细胞DNA倍体与周期检测与分析

细胞周期（cell cycle）是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段，是细胞从2倍体到4倍体再分裂成2倍体的过程。

碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料。可以与DNA结合，其荧光强度直接反映了细胞内DNA含量。因此，通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时，可以将细胞周期各时相区分为G1/G0，S和G2/M三期，从而可通过流式直方图对各时相细胞百分率进行分析。

04

细胞凋亡的检测与分析Annexinv/PI双染法

细胞凋亡（Apoptosis）是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。通过流式细胞术分析，可快速准确的得到细胞处于早期、晚期凋亡的细胞比例，反映药物处理对细胞状态的影响。

在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine，PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（EGFP、FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）不能透过完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

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Q1：(AnnexinV-染料)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。Annexin V-/PI+越多，实验结果越不可信，建议实验中尽量控制这一象限细胞比例。

Q2: (AnnexinV+染料)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。

Q3：(AnnexinV-染料)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。

Q4：(AnnexinV-染料)-/PI--，此区域的细胞为活细胞。

05

分离纯化

流式分选术应用的运用解决了细胞学研究中一个很重要的课题分离纯化，尤其是需要研究细胞功能时，如收集细胞培养上清通过ELISA检测细胞分泌的细胞因子，细胞共培养检测细胞的功能等，都需要得到高纯度的细胞。

多重荧光标记的流式细胞分选技术检测小鼠肌卫星细胞数量

细胞的活性和状态：流式细胞仪不但可探测细胞表面的荧光，也可探测细胞内的荧光。因此，如果要检测细胞表面的分子，一定要保证细胞的活性，还应尽可能保持细胞静止，通常在4度进行操作。否则，荧光抗体进入死细胞内，会产生非特异结果。

封闭抗体的应用是必不可少的，因为大多数的免疫细胞表面都表达有Fc-R。细胞与抗体相互作用后，一定要用FACS缓冲液洗2~3次，以除去游离的抗体。

单染色时以FACS最常用，FITC标记抗体荧光比较稳定而且价格合适。

如果同时要检测两种以上的分子，一定要选择不同波长的荧光所标记的抗体。