癌症研究打开新思路——《Nature》发表癌症基因扩增新研究

一直以来大家都默认基因都是在染色体上，染色体外DNA（ecDNA）这一概念的出现可以说颠覆了每个人的传统认知。这说明在过往的研究中，我们的研究方向可能是错误，癌症基因实际上不在我们关注的染色体上。这也为癌症研究打开了一扇新的大门。
 
ecDNA存在于染色体外，是人类癌细胞中很常见的高度开放DNA 颗粒。因为它们可以通过基因扩张和改变基因调节来介导癌基因的高表达，被认为与肿瘤的异质性和耐药性有关。
 
编码致癌基因ecDNA它是癌症基因组的一般特征，也是癌症进展的强大驱动因素。ecDNA从100千碱基到几兆碱基不等的共价闭合双链。由于缺少着丝粒，ecDNA在细胞分裂过程中随机分布，并可重新整合到染色体中，因而也可作为某些染色体扩张的前体。ecDNA它具有较高的染色质可及性，但缺乏较高的染色质致密性，且包含内源性致癌基因增强子元件，表明癌基因增强子可以通过调节依赖性来扩大转录。ecDNA在细胞分裂期间或DNA受伤后会相互聚集，但聚集后的生物学后果尚不清楚。
 
在《Nature》出版题为“ecDNAhubs drive cooperative intermolecular oncogene expression ”的论文研究了致癌ecDNA细胞核空间、表观遗传因素和转录调节，发现间期细胞核中聚集的ecDNA它可以驱动分子间增强子信号，促进癌基因表达的扩展。

 
ecDNA促进癌症基因表达
研究团队通过DNA荧光原位杂交（FISH）观察间期细胞核中的细胞核ecDNA聚集点，包括前列腺癌细胞系PC3（MYC扩增）、结直肠癌细胞系COLO320-DM（MYC扩增）、多形性成胶质细胞瘤细胞系HK359（EGFR扩增）和胃癌细胞系SNU16（MYC和FGFR2扩增）。结果显示，一切ecDNA在阳性癌细胞中，有数十到数百个单独的癌细胞ecDNA分子，ecDNAFISH它们基本上集中在间期细胞核中，研究小组将ecDNA之间强烈的聚集称为ecDNA中心。经过进一步的实验，发现各种癌症类型和原发性肿瘤都存在ecDNA聚集。
 
研究人员利用DNA和新生RNAFISH，在PC3和COLO320-DM细胞中观察到活跃转录MYC等位基因并计算每个基因ecDNA分子的MYC转录概率。大多数新生MYCmRNA转录本来自ecDNA中心，而不是染色体。另外，还有单子ecDNA相比，ecDNA中心转录活动较高。因此，当ecDNAs中心聚集时，每一个ecDNA分子更有可能转录致癌基因。  
BRD4连接ecDNA中心和转录
癌基因MYC包含MYC浆细胞瘤转化迁移基因1（PVT1，拷贝数扩增相关的lncRNA，已知的癌症相关区域)，两侧是由组蛋白H3乙酰化赖氨酸27（H3K27ac）和BET蛋白（如BRD4)标记的超级增强因子。检查活细胞MYCecDNA，研究人员在COLO320-DM细胞的MYCecDNA中插入了Tet-operator（TetO）阵列，并用Tet-eGFP标记了ecDNA，以尽量减少GFP二聚化。活细胞成像显示，多个动态核病变对应ecDNA聚集。内源性BRD4表位标记显示，BRD4在TetO标记的ecDNA中心高度富集。通过对H3K27ac和BRD对染色质进行测序和染色质免疫沉淀分析，显示活性标记H3K27ac的ecDNA也被BRD4占据。
为了确定BET蛋白在ecDNA研究人员专注于同源结直肠癌细胞系COLO320-DM（MYCecDNA）和COLO320-HSR(来自同一患者的肿瘤)。TetO-GFPCOLO320-DM细胞中的活细胞成像显示，ecDNA在有丝分裂过程中，中心被分解成较小的颗粒。分解后，ecDNAs再次聚集成大中心。值得注意的是，有丝分裂后，ecDNA中心重新聚集被JQ1（BRD4抑制剂)阻断。结果表明，在COLO320-DM细胞中，ecDNA中心的形成、维护和肿瘤基因转录BET蛋白H3K27ac相互作用具有独特的依赖性。  
ecDNA反式激活中心
为了将ecDNA结构与MYC转录调控联系在一起，研究团队重建了五种正交方法COLO320-DM的ecDNA，报告了最大的已知组装ecDNA结构，包含PVT1-MYC融合、标准MYC多个染色体起源的序列和序列(6、8、13、16号染色体)的复制品，并且利用DNA FISH验证了PLUT、PCAT1和MYC基因重建预测ecDNA上共定位。
研究团队在COLO320-DM在细胞中观察到PVT起动子处强BRD4结合，但在COLO320-DMecDNA细胞中没有观察到。因PVT1启动子能被MYC激活，研究团队假设PVT1-MYC融合可实现MYC避免表达的正反馈PVT1和MYC在几种人类癌症中观察到启动子之间的过度表达PVT1重排和基因融合驱动基因过度表达。
 
接下来，研究人员确定了癌基因的高表达ecDNA调控元件。72049个来自COLO320-DM和COLO320-HSR单细胞配对细胞ATAC–seq和RNA-seq，经校正MYC复制数确定47个和高MYC表达相关的ecDNA目前驱动调控元件ecDNA上MYC癌基因表达PVT1启动子（PVT1p）在ecDNA该中心接受了广泛的组合增强子输入。进一步的实验表明，分子间增强子-启动子ecDNA研究人员证实了该中心的激活PVT1p作为一种DNA可反式激活元件ecDNA中心。  
ecDNA间分子调节
研究人员进一步研究了如何准确定位和干扰分子间增强子基因的相互作用。人类胃癌细胞系SNU16是包含8号和11号染色体的研究对象MYC成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）扩增子。H3K27ac染色质免疫沉淀和测序显示FGFR2和MYCecDNA分子间接触，焦点相互作用丰富。CRISPR干扰（CRISPRi）确定靶向候选调控元件MYC或FGFR与顺式和反式表达相关的功能元件。
?
实验结果表明，FGFR2和MYCecDNA这两个扩增子上的增强子已经被共同选择和激活MYC表达。MYC然后激活蛋白质FGFR2表达。顺式和反式调节元件之间几乎没有重叠，表明分子间增强子元件直接修改反式基因表达，而不是通过下游效应。癌症类型中的分子间ecDNA相互作用评估显示，ecDNA分子间增强子-基因激活发生在不同的肿瘤基因位点和各种癌症类型。  
综上所述，上述研究表明ecDNA群体行动促进了新的分子间增强子基因相互作用和癌基因过度表达，并可发生在不同的肿瘤基因位点和各种癌症类型中。不同于传统的顺式染色体转录，ecDNA中心反式调节可以实现分子间转录调节，对如何更好地实现癌基因转录具有重要启示。未来的研究可能会发现，在各种癌症类型症中介机构ecDNA将活性蛋白质转录为潜在的治疗目标，癌症研究将进一步进入新领域。
 
 
 
参考资料：
[1]WU S, TURNER KM, NGUYEN N, et al. Circular ecDNA promotes accessible chromatin and highoncogene expression[J]. Nature, 2019, 575(7784): 699-703.DOI:10.1038/s41586-019-1763-5.
[2]TURNER K M,DESHPANDE V, BEYTER D, et al. Extrachromosomal oncogene amplification drivestumour evolution and genetic heterogeneity[J]. Nature, 2017, 543(7643):122-125. DOI:10.1038/ nature21356.
[3]ecDNA hubsdrive cooperative intermolecular oncogene expression.