一个突破，迎来兔单抗药物研发的春天

　　2019年10月8日，美国食品药品监督管理局(FDA)批准了诺华的Beovu®(brolucizumab)注射剂用于治疗wet-AMD。这是FDA批准的首个兔源单抗药物。

　　——先来了解下引起wet-AMD的罪魁祸首——

　　都说解决问题要先找到根源，引起wet-AMD的根源就是VEGF-A蛋白。wet-AMD是由黄斑下血管过度增生引起的一种慢性退行性眼病，而VEGF是一种促进黄斑下方异常血管生长的蛋白质，黄斑是负责清晰的中央视力的视网膜区域。

　　VEGF-A ➯ 促进异常血管生长 ➯ 异常血管液体泄露聚集渗入视网膜 ➯ 积聚的液体导致视线模糊、扭曲，甚至失明

　　——接下来看Beovu是如何大展身手的——

　　Beovu可以结合VEGF-A，通过抑制VEGF信号通路，进而抑制异常血管增生以及液体渗入视网膜，从而改善视力。

　　Beovu是第一个获得FDA批准的抗VEGF药物，与aflibercept相比，减少了更多的积液。在三个月的负荷期后立刻给药三个月，疗效不受影响。

　　Beovu(brolucizumab)的本质是一种人源化单链抗体片段(scFv)，是目前达到开发阶段的临床上最先进的人源化单链抗体片段。单链抗体片段体积小、组织渗透性强、可从全身循环里快速清除及其药物释放特性，其在药物开发中备受追捧。

　　单克隆抗体的发展单克隆抗体技术起源于Kohler等创建的体外鼠源杂交瘤技术。经几十年发展，鼠单抗已从单纯的生物实验室科研及临床诊断发展到治疗性抗体药物。目前的抗体药物大多来源于小鼠或噬菌体展示库。2019年3月，首个骆驼源纳米抗体Cablivi获得FDA批准上市。2019年10月，迎来首个兔单抗药物Beovu，是抗体药物发展历程中的一个里程碑。临床使用的大多数治疗用抗体均需进行体外亲和力成熟，以提高抗体的亲和力。这一过程耗时长(8-12个月)，最终亲和力在10-9mol/L。而兔单抗不需经体外亲和力成熟，就能达到10-11至10-13mol/L。另外，兔与人的抗体同源性更高，约60%～76%，而小鼠与人的抗体同源性为57%～72%，说明兔单抗的人源化比鼠单抗更容易实现。

　　兔单克隆抗体具有高亲和力、高特异性、高灵敏度，可识别更多新型表位，杂交瘤克隆数更多，容易人源化等优势。因此，用兔单克隆抗体开发治疗用抗体药物的前景更广阔。

　　兔单抗药物的上市，揭开了抗体药物研发的新篇章，发展潜力不可限量。

　　这里有一个，兔源天然scFv抗体库，对抗体药物的研发很重要。

　　兔源天然scFv库优势1. 分为κ和λ两种轻链亚型的单链抗体库，与大多数商业化混合库不同，即可用于筛选κ型抗体，也可用于筛选λ型的高亲和力抗体。2. 序列正确性高，来源丰富，库容可达十亿级别。3. 两步法建库，先连入轻链再连入重链，保证了库的高质量和多样性。

　　4. 带有His标签，可直接用phagemid表达抗体，His标签纯化。

　　案例展示

　　Rabbit ScFv phage display libraries

　　1.动物免疫：3只兔子，经四轮免疫后最终效价如下图。

　　2.兔免疫库的构建：库容可达1.01×109 pfu，插入正确率>95%，序列正确率>85%。

　　Agarose gel electrophoresis of Colony PCR, Insertion accuracy=97.6%

　　3.兔免疫库的淘选和筛选：文库经过四轮淘选富集后，我们对其进行了96个单克隆筛选，阳性克隆比例超过40%，经过对阳性克隆的测序分析，最终获得了6条不同的阳性兔单抗序列。

　　4.检测验证：将筛选得到的阳性scFv形式的抗体序列转化为完整的IgG抗体，最终进行ELISA验证。