想要了解蛋白表达？你的先了解SDS-PAGE才行

　　PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，也叫聚丙烯酰胺凝胶电泳，是以聚丙烯酰胺凝胶为支持介质的一种常用的电泳技术。聚丙烯酰胺凝胶是由单体的丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合的过程中会受到自由基的催化。催化聚合的常用方法为化学聚合法和光聚合法，化学聚合以过硫酸铵(APS)为催化剂，以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。PAGE有Native-PAGE(非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳)和 SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶)两种形式。Native-PAGE过程中蛋白质能保持完整状态，并依据分子量大小、形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。

　　而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同，就可以分开蛋白质。

　　SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇能使半胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS 胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。

　　在SDS-PAGE的实验过程中，有可能会遇到各种层出不穷的问题

　　SDS-PAGE二十二问给你答案

　　1、SDS-PAGE中各主要成分的作用是什么?

　　聚丙烯酰胺

　　丙烯酰胺为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关。

　　制胶缓冲液

　　浓缩胶选择pH6.8，分离胶选择pH8.8，选择Tris-HCl系统。

　　TEMED与AP

　　AP 催化单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合成聚丙烯酰胺。TEMED是催凝剂，可加速AP催化作用。

　　SDS

　　阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物， SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，可利用分子量的差异将各种蛋白质分开。

　　甘氨酸

　　它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。此处pH值较高， 有利于甘氨酸的离子化，所形成的甘氨酸离子穿过堆集的蛋白质并紧随氯离子之后，沿分离胶泳动。从移动界面中解脱后，SDS-蛋白质复合物成一电位和pH值均匀的区带泳动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小得到分离。

　　上样缓冲液

　　蛋白上样缓冲液(loading buffer)是一种以溴酚蓝为染料，5倍浓缩的SDS-PAGE凝胶电泳上样缓冲液,用于常规的SDS-PAGE蛋白电泳样品上样。一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散到电泳缓冲液。

　　2、样品如何处理?

　　根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：

　　1、还原SDS处理

　　在上样buffer中加入SDS和DTT(或β-巯基乙醇)后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中只根据分子量来分离。

　　注：一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5 min，再离心加样。

　　2、带有烷基化作用的还原SDS处理

　　碘乙酸胺的烷基化作用可以很好并经久牢固地保护SH基团，得到较窄的谱带。另外碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。

　　3、非还原SDS处理

　　生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1% SDS沸水中煮3 min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。

　　4、两块玻璃板之间灌胶,胶为什么总是不平?

　　玻璃没有洗干净。

　　过硫酸铵和TEMED的用量不合适，用量相对较多，凝胶凝固过快胶就会不平。

　　加完试剂以后没有很好地摇匀，导致有些部位的聚合剂浓度过高，聚合相对较快造成胶不平。

　　灌胶后没有立刻用水或者异丙醇压胶面：边缘胶是不容易聚合完全的，灌完胶后要立即加异丙醇覆盖。浓度越低的胶越不要使用双蒸水压顶。另外还可以在压顶试剂如异丙醇中添加少许AP来增加边缘胶的凝聚强度。

　　温度也是影响胶聚合的重要因素，如果为了让胶更快地凝固而把胶放到50度的温箱，由于受热不均匀，也会造成胶聚合不均匀。4

　　怎样防止胶漏?

　　每次电泳完后，洗净玻璃、胶条和其他附件。

　　避免玻璃边缘破损很重要，尤其是下面和胶条接触的地方。

　　找一块很平的桌面，使两块玻璃底面非常齐。

　　胶条一定要干，跑完电泳后，胶条可放在实验台上晾着。

　　下面的胶条注意不要老化，如果有裂纹的话可用保鲜膜垫在上面，或者反过来用。

　　玻璃在使用过程中容易造成小的缺口，从而导致封条无法完全密封。装好架子后，可在玻璃底边抹上一层薄薄的凡士林(两边多点，容易从两边漏)。转移到电泳槽的时候去掉封条，把底上的凡士林擦干(注意一定要擦干净，尤其是少量进入了两块玻璃之间空腔的，因为凡士林不导电，会影响电泳的效果)。

　　可以在海绵垫下再垫一些纸，使它与玻璃贴的更紧密，或者在玻璃底部用琼脂糖封上。

　　先把两块玻片放在夹子上，使底部对齐，再夹紧两块玻片，然后取下再在其下面垫上垫片。5

　　分离胶加上后为什么要立即加水?

　　一是为了使分离胶界面保持水平(用水就可以把它压平)，使蛋白质分子跑时在同一水平线上。

　　二是阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。6怎么处理“ 微笑”(两边翘起中间凹下)条带的形成?

　　主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致(多出现于较厚的凝胶中)，可待其充分凝固再做后续实验。

　　7怎么处理“皱眉”(两边向下中间鼓起)形带原因?

　　常是由于垂直电泳时电泳槽的装置不合适引起的,当凝胶和玻璃板组成的"三明治"底部有气泡或靠近隔片的凝胶聚合不完全便会产生这种现象。可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。

　　8出现拖尾现象应该怎么办?

　　主要是样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。可在加样前离心、选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂、重新配制时间过长的电泳缓冲液或者降低凝胶浓度。

　　9出现纹理(纵向条带)现象应该怎么办?

　　主要是不溶性样品颗粒引起的，可在加样前离心或加适量样品促溶剂。

　　10蛋白带偏斜怎么办?

　　常常是由于滤纸条或电极放置不平行或加样位置偏斜而引起，检查位置是否正确并作出相应调整。

　　11蛋白带过宽，与邻近蛋白泳道的蛋白带相连?

　　这是由于加样量太多或加样孔泄漏引起的，可减少加样量。

　　12蛋白带模糊不清和分辨不佳?

　　聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。

　　建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4度冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。

　　为了提高分辨率,不要加过多的样品,小体积样品可跑出窄带。

　　加样后应立即电泳,以防止扩散。

　　选择合适的凝胶浓度,使组分得以充分的分离。

　　样品的蛋白水解作用(系统中的内源性蛋白酶会水解样品蛋白)也引起扩散而使分辨率降低，在缓冲液中加蛋白酶抑制剂可减少这种情况的发生。

　　13什么是“鬼带”，如何处理?

　　在跑构象复杂的蛋白质分子时，“鬼带”常会出现在泳道顶端(有时在浓缩胶中)的一些大分子未知条带或加样孔底部有沉淀。主要是还原剂在加热过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量要比目标条带大，有时不能进入分离胶。但它却与目标条带有相同的免疫学活性，在WB反应中可见其能与目标条带对应的抗体作用。可在加热煮沸后，再添加适量的DTT或Beta-巯基乙醇，以补充不足的还原剂或加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。

　　14为什么溴酚蓝不能起到指示作用?

　　我们在实验中常会遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象,这主要与缓冲液和分离胶的浓度有关，可更换正确pH值的缓冲液或降低分离胶的浓度。

　　15为什么电泳的条带很粗?

　　电泳中条带很粗是常见的事，主要是蛋白未浓缩好的原因。可适当增加浓缩胶的长度，保证浓缩胶贮液的pH正确(pH6.7)或适当降低电压。

　　16为什么电泳电压很高而电流却很低呢?

　　这种现象一般初学者容易遇到。比如电压50 v以上，可电流却在5 mA以下。这主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路所致。包括：a.内外槽装反;b.外槽液过少;c.电泳槽底部的绝缘体未去掉(比如倒胶用的橡胶皮)。将电泳槽正确装配即可。

　　17浓缩胶与分离胶断裂、板间有气泡对电泳有影响吗?

　　一般对电泳不会有太大的影响。前者主要原因是拔梳子用力不均匀或过猛所致，后者是由于在解除制胶的夹子后，板未压紧导致空气进入引起的。

　　18蛋白带型聚团是什么引起的?

　　上样过量：降低蛋白上样量或降低蛋白浓度。

　　样品粘度过大：延长煮沸时间。

　　样品中含有不溶物质：离心或过滤样品以除去特定污染物。

　　制胶不佳：确保制胶均匀，一次完成。19凝胶时间不对，或慢或快，怎么回事?

　　通常胶在30 min-1 h内凝固。如果凝的太慢，可能是TEMED和APS剂量不够或者失效。APS应该现配现用。TEMED不稳定，易被氧化成黄色，以此可以鉴定TEMED的质量。如果无法获得无色透明的TEMED，只能适当增加用量以保证聚胶速度。如果凝的太快，可能是APS和TEMED用量过多，此时胶太硬易裂，电泳时易烧胶。

　　20电泳时间比正常要长?

　　可能由于凝胶缓冲系统和电极缓冲系统的PH选择错误，即缓冲系统的PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。

　　21蛋白Marker条带缺失或条带模糊怎么办?

　　分离胶浓度不正确：配置浓度正确的分离胶。

　　缓冲液放置时间过长：定期更换缓冲液。

　　甲叉丙烯酰胺贮存液放置时间过长或配置不准确：及时更新贮存液，此贮存液配制时在37℃水浴溶解30 min以上。

　　电泳时间过长：观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间。22条带跑得比正常的窄?

　　可能因为胶凝得不均匀，聚合得不是很好：灌胶的时候尽量混匀。

　　可能与拔梳子有关：拔梳应该迅速。

　　冲洗加样孔时要小心，以免把上样带扭曲。

　　胶配好了用枪吹几下再灌胶。

　　等指示剂跑到两层胶交界成一线时，再调高电压。

　　可能是样品的问题：如果盐浓度较高，便会挤压其它条带，致使条带宽窄不一。

　　常见的原因是每孔上样量不均匀：应确保每孔中上样量一致。

　　有可能是电极缓冲液，也有可能是凝胶缓冲液：更新缓冲液。