哺乳动物瞬时表达系统-一种多快好省的蛋白表达技术

　　近年来，越来越多的重组蛋白作为生物药应用于医疗（特别是人源化的单克隆抗体在生物领域的大量使用）。特别是在临床研究中，经常会要求我们在短时间内生产一定量的重组蛋白产品，所以，如何迅速实现这一目标就显得更加的迫切。在之前我们和大家介绍过有关使用稳定表达细胞株生产重组蛋白的内容，但是因为其过程繁琐且周期过长，所以，无法满足这个需求。而瞬时基因表达技术则因为其能在数周之内生产几百毫克的重组蛋白，所以得到广泛的应用。

　　那么，它具体是怎么实现的呢?下面，普健生物就和大家具体聊聊这项真核重组蛋白表达的神技-哺乳动物细胞瞬时表达技术。

　　哺乳动物细胞瞬时表达技术的优势主要体现在宿主细胞系、表达载体的最优化设计以及转染条件的选择三个方面。

　　宿主细胞系

　　哺乳动物细胞的优势主要体现在其翻译后的修饰能力，比如糖基化、磷酸化和二硫键正确折叠等，能够让重组蛋白具备生物活性。在瞬时表达中，我们最常用的哺乳细胞是HEK293和CHO细胞及两者的亚系。

　　HEK293细胞

　　HEK293细胞生长于静止培养基时中度贴壁,每30 h传一代，最高生长密度能达到2-5×106 cells/mL。因其采用人源细胞改造而成，表达人源重组蛋白药物时不会引起免疫反应，是TGE 中最常用的细胞系。有研究指出，HEK293细胞中瞬时表达的结果可用于预测重组蛋白在CHO细胞稳定表达的水平和质量。

　　CHO细胞

　　CHO细胞可以说是最早用来建立体外培养的细胞系之一，作为生产药物蛋白的宿主细胞，它一直备受青睐。 到2012年为止，在美国及欧洲市场上 的28个抗体药物中有12个来自CHO细胞。CHO细胞本身粘附性强，需进行悬浮适应和无血清驯化，传代时间为18 h，细胞生长密度可达5×106-1×107 cells/mL。虽然有报道称CHO细胞的糖基化方式与人体细胞略有不同，但是有鉴于其在药物蛋白稳定生产方面的良好表现，所以，在工业蛋白表达上使用非常的广泛。

　　HEK293及CHO细胞的改造亚系

　　早期研究发现，猴病毒40(SV40)和埃巴病毒(EBV)能维持其宿主细胞周质中的游离质粒拷贝数，并通过特有的病毒特性加强转录和翻译。对SV40来说，这种效果是由SV40大T抗原与其复制起点 SV40 ori 结合引起的。而源于EBV病毒的EBNA-1蛋白和oriP的结合以及小鼠多形瘤病毒大 T抗原与多形瘤复制起点Pyori的结合也起到类似的作用。基于这些发现，用建立稳定细胞系的方法对两种细胞进行改造，先后得了HEK293-T、HEK293-EBNA和293-6e以及CHO EBNA1c-3E7、CHO EBNALT和Expi-CHO等细胞亚系，分别可稳定表达EBNA-1、SV4大T抗原或小鼠多形瘤病毒T抗原。当转入的载体中携有能与这些蛋白相结合的复制起点时，游离态质粒的拷贝数将得以增加并维持，进而加强表达。

　　表达载体的最优化设计

　　哺乳动物细胞中基因表达受一系列事件影响，包括转录RNA加工、mRNA转运及降解、翻译、翻译后修饰及分泌(对于分泌蛋白)。设计载体时可通过添加及组合各种调控元件影响这些事件，使TGE蛋白表达最优化。

　　主要影响因素

　　影响PEI介导瞬时转染效率的因素主要包括DNA用量、DNA与PEI质量比以及转染时的细胞密度。DNA的最佳用量通常在1μg/106 cells，其表达质粒用量极大，成为大规模TGE的主要成本之一。越来越多证据表明，用一定比例的填充DNA(如蜥蜴精子中的DNA)代替实际表达质粒并不会降低重组蛋白表达，同时可节省表达质粒用量。DNA与PEI的质量比应在1：2-1：3左右，太低影响转染效率，过高则可能造成较高的细胞毒性。转染时的细胞密度应达到 1-2×106 cells/mL，而悬浮培养的HEK293和CHO细胞多生长在0.5-2×106 cells/mL密度，转染前需经离心或沉降使细胞浓缩至合适密度。

　　其他因素

　　其他因素如DNA与PEI的混合孵育时间、转染试剂占总体积比曾被认为极为重要，但最近的研究表明直接按顺序加入DNA、PEI到细胞中，也得到类似的转染效率和表达量。此外某些商业化培养基中用以减少细胞聚集的葡萄糖硫酸酯以及用于替代转铁蛋白的柠檬酸铁都会阻碍PEI介导的瞬时转染。总体上看，PEI介导HEK293细胞系瞬时转染效率约为60%，而介导CHO细胞瞬时转染则相对困难。